Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediando utilización de unas cepas mejoradas de la familia de las enterobacteriáceas.

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) Fermentación de los microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, que producen el L-aminoácidodeseado, en los que se debilita, en particular se desconecta, el gen glpR o a la secuencia de nucleótidos quelo codifica, en un medio que contiene glicerol y

b) enriquecimiento del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediando utilización de unas cepas mejoradas de la familia de las enterobacteriáceas

Este invento se refiere a un procedimiento para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-treonina y L-triptófano, conteniendo el medio glicerol como fuente de carbono, mediando utilización de unos microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, en los cuales el gen glpR es debilitado, y que muestran una capacidad mejorada para el aprovechamiento de glicerol y por consiguiente para la formación y el enriquecimiento de Laminoácidos.

Estado de la técnica Los L-aminoácidos, en particular la L-treonina y el L-triptófano, encuentran utilización en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy especialmente en la nutrición de animales.

Es conocido el hecho de que ciertos L-aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de las enterobacteriáceas, en particular de Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto, mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones, o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes a unos antimetabolitos tales como p.ej. el compuesto análogo a la treonina ácido a-amino-º-hidroxivaleriánico (AHV) , o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen unos L-aminoácidos tales como p.ej. L-treonina. La resistencia frente al compuesto análogo al triptófano 5-metil-DL-triptófano (5-MT) distingue p.ej. a una cepa, que produce L-triptófano.

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de la familia de las enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción. Unas informaciones recopilativas acerca de la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se pueden encontrar en la cita de Neidhardt (coordinador de edición) : Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (Escherichia coli y Salmonella, biología celular y molecular) , 2a edición, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU, (1996) .

Toda la industria de la fermentación para la producción de L-aminoácidos trabaja hoy en día en la mayoría de los casos basándose en glucosa o sacarosa como fuente de carbono, que se obtienen en el caso de la elaboración de productos agrarios. Puesto que, sin embargo, el precio de estas fuentes de carbono está subiendo, es deseable una alternativa que se pueda llevar a cabo tecnológicamente para la producción de los L-aminoácidos, de manera preferida de L-treonina y L-triptófano, con un aprovechamiento mejorado de un material más barato como materia prima alternativa para la fermentación.

Es conocido el hecho de que los microorganismos que producen L-aminoácidos crecen sobre glicerol como única fuente de carbono (véase el documento de patente de los EE.UU. US-A-5.175.107) . El glicerol (propanotriol) es un componente natural de los aceites y las grasas, y une como un "puente" a las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. La molécula de glicerol es fuertemente polar y por lo tanto bien soluble en agua. Como producto de copulación o acoplamiento, esta valiosa materia prima resulta en el caso de la producción de un gasóleo biológico (éster metílico de ácido graso de colza) y se emplea en productos cosméticos, farmacéuticos, alimentos y para usos técnicos. Para el empleo de glicerol como una materia prima para la producción de componentes de piensos es decisiva la baratura. Se ha de partir del hecho de que con una producción creciente de gasóleo biológico, el glicerol se volverá interesante para el sector de los piensos.

Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción mejorada por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-treonina y L-triptófano.

Descripción del invento Es objeto del invento un procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de Ltreonina y L-triptófano, conteniendo el medio glicerol como fuente de carbono, mediando utilización de unos microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que ya producen en particular L-aminoácidos, y en los que por lo menos el gen glpR o unas secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, es debilitado o respectivamente son debilitadas, en particular es desconectado o respectivamente son desconectadas, que muestran una capacidad mejorada para el aprovechamiento de glicerol y que producen L-aminoácidos, en particular L-treonina y L-triptófano, de un modo mejorado.

Cuando en lo sucesivo se mencionen L-aminoácidos o aminoácidos, se han de entender por estos conceptos uno o varios aminoácidos inclusive sus sales, que se escogen entre el conjunto que se compone de L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-arginina y L-homoserina. Se prefieren especialmente la L-treonina y el L-triptófano.

El concepto de "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o la desconexión de la actividad intracelular o de la concentración en un microorganismo de una o varias enzima (s) o proteína (s) , que es (son) codificada (s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se utiliza un promotor más débil, que el que se encuentra en el microorganismo no recombinante o en la cepa parental para la correspondiente enzima o respectivamente proteína, o un gen o respectivamente un alelo, que codifica una correspondiente enzima o respectivamente proteína con una actividad más baja, o respectivamente que desactiva al marco de lectura abierto o al gen para la correspondiente enzima o respectivamente proteína, y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Por el concepto de marco de lectura abierto (ORF, acrónimo del inglés "open reading frame") se designa a un segmento de una secuencia de nucleótidos, que codifica o puede codificar una proteína o respectivamente un polipéptido o un ácido ribonucleico, a la (al) que no se le asigna ninguna función de acuerdo con el estado de la técnica. Después de la asignación de una función al correspondiente segmento de la secuencia de nucleótidos se habla por lo general de un gen. Por el concepto de "alelos" se entienden por lo general unas formas alternativas de un gen establecido. Las formas se distinguen por ciertas diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Por el concepto de "un producto génico" se designa por lo general a la proteína o al ácido ribonucleico que ha sido codificada/o por una secuencia de nucleótidos, es decir un ORF, un gen o un alelo.

Mediante las medidas técnicas del debilitamiento se disminuye la actividad o la concentración de la correspondiente proteína por lo general a 0 hasta 75 %, 0 hasta 50 %, 0 hasta 25 %, 0 hasta 10 % o 0 hasta 5 % de la actividad o la concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente se disminuye la actividad o la concentración de la proteína en el microorganismo recombinante o la cepa parental para la correspondiente enzima o respectivamente proteína. Por el concepto de "microorganismo no recombinante" o "cepa parental" (en inglés "parent strain") se entiende el microorganismo, en el que se llevan a cabo las medidas técnicas del invento.

Es objeto del invento un procedimiento para la producción de L-aminoácidos por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia de las enterobacteriáceas, que está caracterizado porque a) los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los que se debilita (n) , en particular se desconecta (n) , el gen glpR o las secuencias de nucleótidos o los alelos, que codifican el correspondiente producto génico, son... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) Fermentación de los microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, que producen el L-aminoácido deseado, en los que se debilita, en particular se desconecta, el gen glpR o a la secuencia de nucleótidos que lo codifica, en un medio que contiene glicerol y

b) enriquecimiento del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que se aísla el L-aminoácido deseado, realizándose que eventualmente quedan en el producto unos componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en ciertas proporciones (desde > 0 hasta 100 %) de éstos.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-treonina y L-triptófano, o unos aditivos para piensos que contienen estos compuestos, mediante la fermentación de unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, caracterizado por que en éstos se debilita, en particular se desconecta, el gen glpR o las secuencias de nucleótidos que lo codifican, y se aísla el producto deseado.

4. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado por que se emplean unos microorganismos, en los cuales se disminuye la actividad o la concentración del producto génico de glpR a un 0 hasta 75 % de la actividad

o la concentración de la proteína de tipo silvestre o en la cepa parental.

5. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, o 3, caracterizado por que se debilita, en particular se desconecta, la expresión del polinucleótido, que codifica el producto del gen glpR.

6. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado por que se disminuyen las propiedades reguladoras y/o catalíticas del polipéptido (la proteína enzimática) , que codifica el polinucleótido del gen glpR.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que para la producción de L-treonina se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los que se refuerza (n) , en particular se sobreexpresa (n) adicionalmente, de manera simultánea, uno o varios genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de

7.1 por lo menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa, la homoserina cinasa y la treonina sintasa,

7.2 el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa, de Cor y nebacterium glutamicum,

7.3 el gen pps, que codifica la fosfoenolpiruvato sintasa,

7.4 el gen ppc, que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa,

7.5 los genes pntA y pntB, que codifican las subunidades de la piridina transhidrogenasa,

7.6 el gen rhtC, que codifica la proteína que media en la resistencia frente a treonina,

7.7 el gen thrE, que codifica la proteína de vehículo y exportación de treonina, de Cor y nebacterium glutamicum,

7.8 el gen gdhA, que codifica la glutamato deshidrogenasa,

7.9 el gen ptsH, que codifica la fosfohistidina proteína hexosa fosfotransferasa,

7.10 el gen ptsI, que codifica la enzima I del sistema de la fosfotransferasa,

7.11 el gen crr, que codifica el componente IIA, específico para glucosa,

7.12 el gen ptsG, que codifica el componente IIBC, específico para glucosa,

7.13 el gen cysK, que codifica la cisteína sintasa A,

7.14 el gen cysB, que codifica el regulador del regulón de cys,

7.15 el gen cysJ, que codifica la flavoproteína de la NADPH sulfito reductasa,

7.16 el gen cysI, que codifica la hemoproteína de la NADPH sulfito reductasa,

7.17 el gen cysH, que codifica la adenililsulfato reductasa,

7.18 el gen sucA, que codifica la subunidad de descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

7.19 el gen sucB, que codifica la subunidad de dihidrolipoíl transsuccinasa E2 de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

7.20 el gen sucC, que codifica la subunidad º de la succinil-CoA sintetasa,

7.21 el gen sucD, que codifica la subunidad a de la succinil-CoA sintetasa,

7.22 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yibD de Escherichia coli.

8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que para la producción de L-triptófano se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los que se refuerza (n) , en particular se sobreexpresan (n) adicionalmente, de manera simultánea, uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

8.1 por lo menos un gen del operón de triptófano, que codifica la antranilato sintasa, la antranilato fosforribosil transferasa, la fosforribosil antranilato isomerasa, la indol-3-glicerofosfato sintasa y la triptófano sintasa,

8.2 el gen serA, que codifica la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa,

8.3 el gen serB, que codifica la fosfoserina fosfatasa,

8.4 el gen serC, que codifica la fosfoserina amino transferasa,

8.5 el gen aroF, que codifica la DHAP sintasa sensible frente a L-tirosina,

8.6 el gen aroG, que codifica la DHAP sintasa sensible frente a L-fenilalanina,

8.7 el gen aroH, que codifica la DHAP sintasa sensible frente a L-triptófano,

8.8 el gen pps, que codifica la fosfoenolpiruvato sintasa,

8.9 el gen pckA, que codifica la fosfoenolpiruvato carboxicinasa,

8.10 el gen tktA, que codifica la transcetolasa A,

8.11 el gen tktb, que codifica la transcetolasa B, y

8.12 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yddG de Escherichia coli.

9. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado por que para la producción de L-treonina se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los cuales adicionalmente, de manera simultánea, se debilita (n) , en particular se desconecta (n) o se disminuye la expresión de uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

9.1 el gen tdh, que codifica la treonina deshidrogenasa,

9.2 el gen mdh, que codifica la malato deshidrogenasa,

9.3 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli,

9.4 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli,

9.5 el gen pckA, que codifica la enzima fosfoenolpiruvato carboxi cinasa,

9.6 el gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa,

9.7 el gen dgsA, que codifica el regulador de DgsA del sistema de la fosfotransferasa,

9.8 el gen fruR, que codifica el represor de la fructosa,

9.9 el gen rpoS, que codifica el factor Sigma38, y

9.10 el gen aspA, que codifica la aspartato amonio liasa.

10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6 u 8, caracterizado por que para la producción de Ltriptófano se fermentan unos microorganismos de la familia de las enterobacteriáceas, en los cuales adicionalmente, de manera simultánea, se debilita (n) , en particular se desconecta (n) o se disminuye la expresión de, uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

10.1 el gen tnaA, que codifica la triptofanasa,

10.2 el gen trpR, que codifica el represor del operón trp,

10.3 el gen tyrA, que codifica la corismato mutasa T y la prefenato deshidrogenasa,

10.4 el gen pheA, que codifica la corismato mutasa P y la prefenato deshidrogenasa,

10.5 el gen mtr, que codifica la proteína de transporte específica para el triptófano,

10.6 el gen tnaB, que codifica la triptófano permeasa,

10.7 el gen aroP, que codifica la proteína transportadora de aminoácidos aromáticos,

10.8 el gen sdaA, que codifica la L-serina desaminasa,

10.9 el gen pgi, que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa, y

10.10 el gen tyrB, que codifica la tirosina aminotransferasa.

11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que se producen unos L-aminoácidos que se escogen entre el conjunto que se compone de L-asparagina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, Lalanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-arginina y L-homoserina.

12. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que se producen unos L-aminoácidos que se escogen entre el conjunto que se compone de L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-homoserina y L-lisina.