Procedimiento para la producción de bioproductos.

Un procedimiento para la producción de un producto biológico, comprendiendo el procedimiento

(i) mantener un primer cultivo celular en suspensión de células vegetales no algales fotosintéticas en condiciones que incluyen el suministro de luz y dióxido de carbono que permite que las células cultivadas realicen la fotosíntesis y de ese modo generar y liberar azúcares, normalmente monosacáridos y/o disacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, y /o fructosa), en el medio de cultivo circundante;

y

(ii) mantener un segundo cultivo de células en presencia del azúcar generado por el primer cultivo celular en suspensión para permitir el crecimiento del segundo cultivo y la producción de un producto biológico.

Procedimiento para la producción de bioproductos Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de aceites vegetales, ácidos grasos y otras fuentes de biocombustibles a partir de células vegetales cultivadas en cultivo de tejido.

Introducción La mención o la descripción de un documento aparentemente publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe tomarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica,

o es el conocimiento general común.

Es bien conocido y descrito que el uso de combustibles fósiles es perjudicial para el medio ambiente y la atmósfera del planeta. También es bien sabido que los combustibles fósiles son un recurso finito que no puede durar indefinidamente.

Como resultado de esto ha habido mucha investigación y la investigación de fuentes de energía alternativas como la nuclear, eólica, solar, pilas de combustible de hidrógeno y los biocombustibles.

La demanda de combustible de origen biológico, es decir, ésteres metílicos de ácidos grasos ha crecido exponencialmente recientemente debido a diversas iniciativas internacionales gubernamentales para reducir la dependencia de los combustibles derivados del petróleo como el gasóleo y la gasolina.

Para satisfacer esta demanda se ha incrementado la presión sobre la agricultura para dedicar más tierras y recursos al cultivo de plantas oleaginosas como la soja, la colza y el maíz y, por lo tanto, hay menos tierra disponible para la producción de alimentos. Esta demanda ha llevado también a la deforestación de ciertas áreas con el fin de sembrar cultivos de semillas oleaginosas.

Es obvio para los expertos en la técnica que este procedimiento es más probable que conduzca a un aumento del calentamiento global y la pobreza del tercer mundo más que aliviarlo.

El cultivo de tejidos de células vegetales se conoce como un procedimiento para propagación de plantas o para el cultivo de tejidos específicos de las plantas con el fin de cosechar productos vegetales específicos.

También es evidente que la producción de aceite vegetal para la producción de combustible es extremadamente intensiva para la tierra, ya que se produce menos de una tonelada de aceite por hectárea de tierra dedicada a la producción. Esto es debido al hecho de que sólo las semillas de la planta producen aceite y sólo ciertos tejidos dentro de la semilla. Por tanto, el resto del tejido de la planta se desperdicia en este procedimiento de producción. Además, cada planta debe ser plantada a una cierta distancia de su vecina (esta distancia dependerá de la especie vegetal utilizada) .

Por lo tanto, se ha hecho evidente que con el fin de satisfacer la creciente demanda mundial de biocombustibles, se requiere una fuente o procedimiento de producción alternativo de estos combustibles.

El procedimiento actual para la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de los aceites vegetales también tiene una desventaja importante, ya que en la producción de los ésteres metílicos los triglicéridos del aceite se descomponen en ácidos grasos libres y glicerina. El volumen de glicerina producida por este procedimiento es actualmente más que la demanda de fuentes industriales para el producto. Esto conducirá a más problemas en el futuro, ya que habrá que desarrollar procedimientos para la eliminación segura de glicerina a gran escala.

Es bien sabido en la técnica que las células vegetales se pueden mantener en cultivo de tejidos. El cultivo de tejidos es un término usado para describir el procedimiento por el que las células vegetales se cultivan fuera de una planta intacta en un medio nutriente adecuado. El cultivo de tejidos se define como un procedimiento en el que partes de una planta se transfieren a un ambiente artificial en el que pueden seguir sobreviviendo. El término cultivo de tejidos tal como se entiende en la técnica se refiere a tejido cultivado que puede consistir en células individuales o grupos de células vegetales, protoplastos o enteros o partes de un órgano de la planta.

En el cultivo de tejidos, las células vegetales se pueden cultivar sobre una superficie sólida como grumos de color pálido conocidos como cultivo de callo o como agrupaciones individuales o pequeñas de células conocidas como cultivo en suspensión. Las células crecidas en cultivo se están dividiendo activamente y se pueden mantener en un estado indefinidamente no diferenciado mediante la transferencia de las células a medio fresco (subcultivo) . Las células cultivadas también pueden ser inducidas a rediferenciarse en plantas enteras.

El cultivo de tejidos es bien conocido en el campo de la biología vegetal y tiene varias aplicaciones, por ejemplo, puede ser utilizado para producir grandes cantidades de plantas o material vegetal en un corto período de tiempo (micropropagación) .

Los cultivos de tejidos vegetales se pueden iniciar desde casi cualquier parte de la planta de origen (denominado explante) , aunque las partes más jóvenes de la planta son en general más útiles, ya que contienen más células que se dividen activamente.

Aunque el cultivo de tejidos es bien conocido en la técnica, las diferentes plantas pueden variar en las condiciones exactas requeridas para mantener las células en cultivo.

Las células en cultivo de tejidos son generalmente diferentes de las de una planta intacta. También es bien conocido en la técnica que las células vegetales cultivadas producen diferentes cantidades y cantidades alteradas de metabolitos (Dicosmo y G Delle Monache, 1995, Phytochemistr y , 39, 575-580) .

El documento WO 2009/093367describe un sistema cerrado que contiene una mezcla de sólido/líquido que contiene azúcar, levadura y cloroplastos, a) una reacción en la que la mezcla sólido/líquido que contiene azúcar es fermentada por la levadura y se produce etanol, b) una reacción en la que el dióxido de carbono producido durante la fermentación de a) se somete a la fotosíntesis por medio de los cloroplastos de la planta y la irradiación con la luz de los diodos emisores de luz y c) una reacción en la que el azúcar obtenido en b) es fermentada por la levadura y el etanol es producido en paralelo y la invención se basa en este descubrimiento. Se describe que los cloroplastos que se utilizan son preferentemente de tal manera que las membranas celulares de la planta se han dividido de tal forma que el azúcar que se produce por la fotosíntesis se fermenta de manera eficiente por la levadura en la solución, y, además, que los cloroplastos de las cianobacterias son los cloroplastos preferidos para su uso.

El documento DE 100 59 372 A1 divulga un sistema en el que un primer cultivo de células de algas fotosintéticas se utilizan para producir hidratos de carbono y, según los autores, estos hidratos de carbono son utilizados para apoyar el crecimiento de un cultivo bacteriano que produce hidrógeno y dióxido de carbono. No hay ejemplos prácticos del sistema y la divulgación parece ser totalmente hipotética. No enseña ni sugiere ninguna alternativa al uso de células de algas para producir hidratos de carbono.

El documento CA 2 005 462 A1 describe sistemas de fijación de carbono fotosintético (PCF) incluyendo microorganismos fotosensibles seleccionados de cianobacterias, algas y bacterias fotosintéticas (página 6, líneas 11-14) y su uso para producir etanol. Esta no es la divulgación de un sistema de cultivo celular de dos células, sino más bien, de acuerdo con el mismo, enseña que es uno y el mismo sistema celular que es a la vez fotosintético y que produce etanol, es decir, las células fotosintéticas son modificadas genéticamente para producir etanol a partir de sus propios productos fotosintéticos. Por lo tanto, el documento CA 2 005 462 A1 no enseña ni sugiere en ningún caso el uso de un cultivo celular en suspensión de células vegetales fotosintéticas y mucho menos para producir azúcares para usar como nutrientes para apoyar el crecimiento del segundo cultivo de células Roitsch y Sinka de 2002, Photosynthetica, 40, 481-492 describen las aplicaciones de cultivos en suspensión fotoautótrofos en botánica y describe que se han establecido un número limitado de cultivos fotoautótrofos que son capaces de crecer con CO2 como única fuente de carbono. Sin embargo, se describe que, por alguna razón desconocida, parece ser difícil de establecer cultivos de células fotoautótrofas. No enseña ni sugiere que los cultivos en suspensión fotoautótrofos se puedan usar para producir azúcar para su uso por un segundo cultivo celular.

El presente inventor ha demostrado sorprendentemente que las células cultivadas a partir de la semilla... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de un producto biológico, comprendiendo el procedimiento

(i) mantener un primer cultivo celular en suspensión de células vegetales no algales fotosintéticas en condiciones que incluyen el suministro de luz y dióxido de carbono que permite que las células cultivadas realicen la fotosíntesis y de ese modo generar y liberar azúcares, normalmente monosacáridos y/o disacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, y /o fructosa) , en el medio de cultivo circundante; y

(ii) mantener un segundo cultivo de células en presencia del azúcar generado por el primer cultivo celular en suspensión para permitir el crecimiento del segundo cultivo y la producción de un producto biológico.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células vegetales no algales fotosintéticas presentes en el primer cultivo celular en suspensión son células vegetales fotosintéticas diferenciadas, tal como una célula que está especializada en la fotosíntesis, por ejemplo una célula de la hoja o del tejido verde de una planta, incluyendo células en empalizada, células del mesodermo foliar o del peciolo, más preferentemente una célula en empalizada.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células vegetales no algales fotosintéticas presentes en el primer cultivo celular en suspensión se aíslan de una planta tolerante al cobre, tal como de Agrostis tenuis.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el primer cultivo celular en suspensión de células vegetales no algales fotosintéticas tiene un nivel medio de cobre en el cultivo de hasta 0, 1 M, por ejemplo, mayor de 0, 01 M, 0, 1 M o 0, 5 M.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que las células del primer cultivo celular en suspensión y las células del segundo cultivo de células están en comunicación fluida entre sí, o cada una se cultiva en recipientes de cultivo separados que no están en comunicación fluida entre sí.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el segundo cultivo de células se mantiene en presencia del azúcar generado por el primer cultivo celular en suspensión a una concentración de azúcar en el intervalo de 20 g/l a 400 g/l, tal como hasta 300 g/l, 200 g/l, 100 g/l, preferentemente a la concentración de aproximadamente 50 g/l.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que las células del segundo cultivo de células son procariotas o eucariotas, tales como células bacterianas, fúngicas, vegetales, animales o humanas, preferentemente microorganismos, tales como levaduras (por ejemplo, una especie de Saccharomyces) .

8. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el producto biológico se selecciona entre el grupo que consiste en (a) las células del segundo cultivo de células o (b) un producto biológico que es sintetizado por las células del segundo cultivo de células, tales como un producto biológico seleccionado del grupo que consiste en al menos un ácido graso y/o aceite, un producto proteico (incluidos los productos proteicos codificados de forma recombinante) y un metabolito, tal como etanol.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de extraer el producto biológico del segundo cultivo celular, y opcionalmente además purificar y/o procesar el producto biológico así extraído.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que es un procedimiento para la producción de al menos un ácido graso y/o aceite a partir de un cultivo de células vegetales, comprendiendo el procedimiento el mantenimiento de un segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite en presencia del azúcar generado por el primer cultivo en suspensión de células y en condiciones tales que las células vegetales productoras de aceite cultivadas producen al menos un ácido graso y/o aceite.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además la etapa de extraer el al menos un ácido graso y/o un aceite del segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite y opcionalmente además su procesamiento para convertirlo en un biocombustible, o además opcionalmente para purificarlo y/o utilizarlo en un procedimiento posterior, tales como por incorporación en un producto alimenticio, cosmético o lubricante.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las etapas, tal como se definen en la reivindicación 10 de mantener el segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite en presencia del azúcar generado por el primer cultivo celular en suspensión y en condiciones tales que las células vegetales productoras de aceite cultivadas producen al menos un ácido graso y/o aceite, y extraer el al menos un ácido graso y/o aceite del segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite como se define en la reivindicación 11, se llevan a cabo por un procedimiento que comprende:

(i) mantener el segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite a un pH de 7, 0

o menos, de tal manera que las células cultivadas sinteticen y secreten al menos un ácido graso y/o un aceite en el medio del cultivo celular en suspensión y

(ii) extraer el al menos un ácido graso y/o un aceite así secretados del segundo medio del cultivo celular en suspensión y, opcionalmente, procesarlo para convertirlo en un biocombustible, u, opcionalmente, purificarlo aún más y/o utilizarlo en un procedimiento posterior, tal como por incorporación en un producto alimenticio, cosmético o lubricante.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el pH al que se mantiene el medio del cultivo celular en suspensión del segundo cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite es un pH de 4, 5 a 6, 5, más preferentemente un pH de 4, 5 a 5, 5 y la secreción de el al menos un ácido graso y/o un aceite de las células cultivadas en el medio de cultivo de la suspensión celular circundante tiene como resultado la formación de un sistema bifásico en el que el al menos un ácido graso y/o aceite se acumulan en una capa separada del medio del cultivo celular en suspensión y la etapa de extraer el al menos un ácido graso y/o un aceite así secretados y/o aceite del medio del cultivo celular en suspensión comprende la extracción directa del al menos un ácido graso y/o un aceite de la capa que se forma dentro del sistema bifásico .

14. El procedimiento de la reivindicación 12 o 13, donde la célula vegetal productora de aceite es de una planta productora de aceite, tales como una planta seleccionada del grupo que consiste de Triticum, Brassica, Zea, Rhus, Olea y Glycine.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que al primer cultivo celular en suspensión de células vegetales no algales fotosintéticas se añade dióxido de carbono procedente de una fuente de dióxido de carbono seleccionada de dióxido de carbono líquido o dióxido de carbono gaseoso obtenidos como un subproducto de un procedimiento de producción de dióxido de carbono.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el primer cultivo celular en suspensión y opcionalmente, también el segundo cultivo de células, es o se mantienen en el sitio del procedimiento de producción de dióxido de carbono.

17. Un sistema de dos cultivos para la producción de un producto biológico, que comprende un primer cultivo en suspensión de células vegetales no algales y un segundo cultivo de células, cada uno como se define en cualquier reivindicación anterior.

18. Un sistema de captura de dióxido de carbono, que comprende al menos el primer cultivo en suspensión de células vegetales no algales como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y el segundo cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

19. El sistema de captura de dióxido de carbono de la reivindicación 18, que comprende además una fuente generadora de dióxido de carbono que genera y alimenta dióxido de carbono en el primer cultivo en suspensión de células vegetales.

20. El uso del sistema de dos cultivos de la reivindicación 17, o del sistema de captura de dióxido de carbono de la reivindicación 18 o 19, para capturar dióxido de carbono.

21. El uso de la reivindicación 20, en el que el dióxido de carbono que se captura es el subproducto de un procedimiento de producción de dióxido de carbono, tal como un procedimiento seleccionado de un procedimiento de generación de energía que utiliza combustibles de carbono, o un procedimiento de producción de biocombustible por microorganismos que libera dióxido de carbono.

22. Una instalación de generación de energía productora de dióxido de carbono o una instalación de generación de biocombustible productor de dióxido de carbono (como bioetanol u otro alcohol) que comprende el sistema de dos cultivos de la reivindicación 17, o el sistema de captura de dióxido de carbono de la reivindicación 18 o 19.