Kit y procedimiento para el marcaje de biomoléculas.

Un kit para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos que comprende un primercomponente (reactivo A) y un segundo componente (reactivo B) en envases separados,

en el que dicho primercomponente comprende una mezcla de un compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria, y en el que dichosegundo componente comprende:

i) una sal de guanidinio de fórmula (a)

en la que

R, R1, R2, R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido ono sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o

R y R1, cuando se toman conjuntamente, o R2 y R3, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anilloheterocíclico de 5 a7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, oR y R2, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o nosustituido que incluye el grupo guanidinio al que están unidos, y

R4 representa un anillo aromático y heteroaromático de 6 a 10 miembros sustituido o no sustituido, y

X- es un anión; o

ii) una sal de uronio de fórmula (b)

en la que

R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido ono sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o

R5 y R6, tomados conjuntamente, o R7 y R8, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R6 y R7, cuando setoman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye elgrupo uronio al que están unidos, y

R9 representa un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógenoal que está unido, y

X- es un anión,

en el que dicho compuesto marcador carboxilado es un compuesto luminiscente que contiene un resto carboxílico.

Kit y procedimiento para el marcaje de biomoléculas Campo de la invención La presente divulgación se refiere a un kit y un procedimiento para el marcaje de biomoléculas.

Estado de la técnica

El marcaje de biomoléculas que llevan grupos amino de gran importancia en muchas áreas de la biología y la biotecnología, en particular en los campos del diagnóstico, los inmunoensayos, los ensayos de ácidos nucleicos, la formación de bioimágenes y los tratamientos.

Para estos propósitos, el compuesto marcador es, con frecuencia, un isotiocianato, un cloruro de sulfonilo o un éster activo. Actualmente se prefieren los ésteres activos, en particular ésteres de N-hidrosuccinimida (NHS) o ésteres de sulfo N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) , véase, p. ej., Hermanson, "Bioconjugated Techniques", Academic Press (1996) . Este tipo de ésteres activos se prepara a partir del ácido carboxílico correspondiente y N-hidroxisuccimidas por medio de carbodiimidas, tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N- (3-dimetilaminopropil) -N’-etilcarbodiimida (EDC) o carbonilimidazol. De forma alternativa, se puede convertir el ácido carboxílico en el éster de Nhidroxisuccinimida (NHS) o sulfo-NHS correspondiente por medio de disuccinimidilcarbonato. El éster sólido se aísla, en general como un sólido, y se almacena en condiciones secas.

En la mayoría de los casos, los ésteres de NHS y sulfo-NHS son muy sensibles a la humedad y no se pueden purificar fácilmente por cristalización o cromatografía. Por lo tanto, suelen contener cantidades considerables y variables de impurezas, especialmente del ácido carboxílico de partida. En algunos casos, el aislamiento del éster activo produce un gran aumento de la unión inespecífica tras la conjugación, p. ej., el éster de NHS del marcador quimioluminiscente ácido hemisuccínico, hidrazida de ácido 7- (4-aminobutil-N-etil) naftaleno-12-dicarboxílico (ABEN-H) capítulo 3, pág. 146, en "Luminescence Immunoassays and Molecular Applications", Van Dyke y Van Dyke Ed. CRC Press (1990) .

Los ésteres activos de NHS y sulfo-NHS de determinados compuestos, especialmente tintes fluorescente, tales como cianinas, se deben almacenar en condiciones muy secas. Sin embargo, al contrario que sus precursores de ácido carboxílico, estos ésteres activos suelen ser sensibles a cargas electrostáticas y, por lo tanto, difíciles de pesar. Por lo tanto, la toma de alícuotas de estos ésteres activos, que frecuentemente son caros de fabricar, es engorrosa; además, incluso sus soluciones en DMF o DMSO tienen una estabilidad limitada, siendo sensibles incluso a cantidades mínimas de humedad.

Del análisis anterior, se deduce que el uso actual de ésteres activos aislados para marcar biomoléculas suele ser poco fiable y antieconómico. Debido a que tanto los ésteres activos como las biomoléculas que se van a marcar suelen ser muy caros, estos problemas suponen una pérdida económica grave.

Por lo tanto, sería deseable tener un procedimiento para la activación rápida, cuantitativa, in situ de un compuesto precursor marcador carboxilado, purificable, estable frente a la humedad.

Bruschi et al., Proteomics 9: 460-468, 2009, divulgan un procedimiento para marcar proteínas plasmáticas usando cianinas yodoacetamidosustituidas.

Los documentos US-A-2003/125561 y WO-A-2008/10941 divulgan el uso de sales de uronio y guanidinio, respectivamente, como agentes de acoplamiento en la síntesis de péptidos.

Sumario de la invención Teniendo en cuenta estas premisas, se aprecia por tanto la necesidad de soluciones de mejora, más eficaces, para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos.

De acuerdo con la invención, se consigue el objetivo anterior gracias a la solución requerida en las reivindicaciones que figuran más adelante, que forman parte de la divulgación de la invención como se proporciona en el presente documento.

Una realización de la presente invención se refiere a un kit para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos que comprende un primer componente (reactivo A) y un segundo componente (reactivo B) , en el que dicho primer componente comprende una mezcla de un compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria, y en el que dicho segundo componente comprende:

i) una sal de guanidinio de fórmula (a)

en la que R, R1, R2, R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6

átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R y R1, cuando se toman conjuntamente, o R2 y R3, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R y R2, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo guanidinio al que están unidos, y R4 representa un anillo aromático o heteroaromático de 6 a 10 miembros sustituido o no sustituido, y

X

es un anión; o ii) una sal de uronio de fórmula (b)

en la que R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R5 y R6, cuando se toman conjuntamente, o R7 y R8, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R6 y R7, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo uronio al que están unidos,

R9 representa un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que está unido, y

Xes un anión,

en el que dicho compuesto marcador carboxilado es un compuesto luminiscente que contiene un resto carboxílico.

Una realización adicional de la presente invención se refiere al uso de una mezcla de dicho compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria (reactivo A) , y una sal de guanidinio de fórmula (a) o una sal de uronio de fórmula (b) (como se definen anteriormente) (reactivo B) para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos.

Otra realización más de la presente invención se refiere a un procedimiento para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos con dicho compuesto marcador carboxilado, que comprende i) proporcionar una mezcla del compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria (reactivo A) , y una entre una sal de guanidinio de fórmula (a) o una sal de uronio de fórmula (b) (como se definen anteriormente) (reactivo B) , ii) poner en contacto la mezcla y la sal de guanidinio o la sal de uronio obteniendo un compuesto marcador carboxilado activado; iii) poner en contacto el compuesto marcador carboxilado activado con la biomolécula obteniendo una biomolécula marcada con el compuesto marcador carboxilado.

Tanto el reactivo A como el reactivo B son químicamente estables durante un periodo de tiempo muy largo cuando se almacenan en ausencia de humedad.

El reactivo A puede ser una solución en un disolvente adecuado, tal como un disolvente aprótico polar miscible con agua, tal como DMF, DMSO, y similares. No obstante, en la mayoría de los casos, se puede evaporar a un sólido.

El reactivo B consiste en un reactivo de acoplamiento de guanidinio o uronio (activador) , tal como tetrafluoroborato de N, N, N’, N’-tetrametil-O- (N-succinimidil) uronio (TSTU) . Estos compuestos son activadores potentes bien conocidos en la síntesis de péptidos, p. ej., en Knorr et al., Tet. Lett. 1990, 30, 1927; en Bannwarth y Knorr, Tet. Lett. 1991, 32, 1157; en Carpino et al. J. Org. Chem., 1994, 59, 695-698; en el documento US 6.825.347) , bien sólidos o disueltos en un disolvente adecuado tal como un disolvente aprótico polar miscible con agua tal como DMF, DMSO, y similares.

Al menos uno de los dos reactivos debe estar en forma de solución.

Tras poner en contacto el reactivo A y el reactivo B, se forma rápidamente una forma activada del compuesto marcador carboxilado, en general, de forma cuantitativa. Esta forma activada se puede usar después para marcar de forma fiable y reproducible una biomolécula que lleva grupos hidroxilo o amino reactivos. Los subproductos de la reacción se eliminan fácilmente mediante técnicas de cromatografía,... [Seguir leyendo]

1. Un kit para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos que comprende un primer componente (reactivo A) y un segundo componente (reactivo B) en envases separados, en el que dicho primer componente comprende una mezcla de un compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria, y en el que dicho segundo componente comprende:

i) una sal de guanidinio de fórmula (a)

en la que R, R1, R2, R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6

átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R y R1, cuando se toman conjuntamente, o R2 y R3, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R y R2, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo guanidinio al que están unidos, y R4 representa un anillo aromático y heteroaromático de 6 a 10 miembros sustituido o no sustituido, y

X

es un anión; o ii) una sal de uronio de fórmula (b)

en la que R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R5 y R6, tomados conjuntamente, o R7 y R8, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R6 y R7, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo uronio al que están unidos, y

R9 representa un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que está unido, y

Xes un anión,

en el que dicho compuesto marcador carboxilado es un compuesto luminiscente que contiene un resto carboxílico.

2. El kit de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto luminiscente se selecciona de cumarinas que contienen un resto carboxílico, fluoresceínas que contienen un resto carboxílico y rodaminas que contienen un resto carboxílico, polimetinas que contienen un resto carboxílico, incluidas cianinas, merocianinas, oxazinas, tiazinas, ftalo-y naftalocianinas, diazaindacenos, 2, 3-dihidroftalazino-1, 4-dionas amino sustituidas, 2, 3

dihidrobenzo[f]ftalazino-1, 4-dionas amino sustituidas, ésteres de acridinio que contienen un resto carboxílico, complejos luminiscentes de Ru (II) , Os (II) e Ir (III) con diazinas aromáticas que contienen un resto carboxílico, complejos luminiscentes de Eu (III) y Tb (III) que contienen un resto carboxílico, un derivado carboxil funcionalizado de luminol y sus análogos.

3. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha amina terciaria se selecciona de trietilamina, N, N-diisopropiletilamina, piridina, N, N-dimetilaminopiridina, 2, 4, 6-trimetilpiridina (colidina) , 4-metilmorfolina, 4-etilmorfolina, 4-morfolinopiridina.

4. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho primer componente y dicho segundo componente se formulan como sólidos o como soluciones.

5. El kit de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho primer componente y dicho segundo componente se formulan como soluciones, seleccionándose el disolvente de N, N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido, sulfolano, N, Ndimetilacetamida, N-metilpirrolidona, acetonitrilo.

6. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de dicho segundo componente está en una proporción molar de 1:1 a 10:1 con respecto a dicho compuesto marcador carboxilado.

7. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha sal de guanidinio de fórmula (a) se selecciona de hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1-il) -N, N, N’, N’-tetrametiluronio (HBTU) , tetrafluoroborato de O- (benzotriazol-1-il) -N, N, N’, N’, N’-tetrametiluronio (TBTU) , hexafluorofosfato de O- (7azabenzotriazol-1-il) -N, N, N’, N’-tetrametiluronio (HATU) .

8. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha sal de uronio de fórmula (b) se selecciona de tetrafluoroborato de N, N, N’, N’-tetrametil-O- (N-succinimidil) uronio (TSTU) , o hexafluorofosfato de N, N, N’, N’-tetrametil-O- (N-succinimidil) uronio (HSTU) , hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2ºxoetilidenaminooxi) dimetilamino-morfolin-carbenio (COMU) .

9. Uso de un compuesto marcador carboxilado, una amina terciaria y un compuesto entre

i) una sal de guanidinio de fórmula (a)

en la que R, R1, R2, R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6

átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R y R1, cuando se toman conjuntamente, o R2 yR3, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R y R2, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo guanidinio al que están unidos, y R4 representa un anillo aromático y heteroaromático de 6 a 10 miembros sustituido o no sustituido, y

X

es un anión; o ii) una sal de uronio de fórmula (b)

en la que R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R5 y R6, tomados conjuntamente, o R7 y R8, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R6 y R7, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo uronio al que están unidos,

R9 representa un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que está unido, y

Xes un anión,

para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos, en el que dicho compuesto marcador carboxilado es un compuesto luminiscente que contiene un resto carboxílico.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho compuesto luminiscente se selecciona de cumarinas que contienen un resto carboxílico, fluoresceínas que contienen un resto carboxílico y rodaminas que contienen un resto carboxílico, polimetinas que contienen un resto carboxílico, incluidas cianinas, merocianinas, oxazinas, tiazinas, ftalo-y naftalocianinas, diazaindacenos, 2, 3-dihidroftalazino-1, 4-dionas amino sustituidas, 2, 3dihidrobenzo[f]ftalazino-1, 4-dionas amino sustituidas, ésteres de acridinio que contienen un resto carboxílico, complejos luminiscentes de Ru (II) , Os (II) e Ir (III) con diazinas aromáticas que contienen un resto carboxílico, complejos luminiscentes de Eu (III) y Tb (III) que contienen un resto carboxílico, un derivado carboxil funcionalizado de luminol y sus análogos.

11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que dicha amina terciaria se selecciona de trietilamina, N, N-diisopropiletilamina, piridina, N, N-dimetilaminopiridina, 2, 4, 6-trimetilpiridina (colidina) , 4-metilmorfolina, 4-etilmorfolina, 4-morfolinopiridina.

12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha sal de guanidinio de fórmula

(a) se selecciona de hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1-il) -N, N, N’, N’-tetrametil uronio (HBTU) , tetrafluoroborato de O- (benzotriazol-1-il) -N, N, N’, N’, N’-tetrametiluronio (TBTU) , hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-1-il) N, N, N’, N’-tetrametiluronio (HATU) .

13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha sal de uronio de fórmula (b) se selecciona de tetrafluoroborato de N, N, N’, N’-tetrametil-O- (N-succinimidil) uronio (TSTU) , o hexafluorofosfato de N, N, N’, N’-tetrametil-O- (N-succinimidil) uronio (HSTU) , hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2ºxoetilidenaminooxi) dimetilamino-morfolin-carbenio (COMU) .

14. Un procedimiento para marcar biomoléculas que llevan grupos hidroxilo o amino reactivos con un compuesto marcador carboxilado, que comprende

i) proporcionar en envases separados una mezcla del compuesto marcador carboxilado y una amina terciaria, y una entre:

-una sal de guanidinio de fórmula (a)

en la que R, R1, R2, R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6

átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R y R1, cuando se toman conjuntamente, o R2 y R3, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R y R2, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo guanidinio al que están unidos, y R4 representa un anillo aromático y heteroaromático de 6 a 10 miembros sustituido o no sustituido, y

X

es un anión; o -una sal de uronio de fórmula (b)

en la que R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y alquinilo sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, o R5 y R6, tomados conjuntamente, o R7 y R8, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que están unidos, o R6 y R7, cuando se toman conjuntamente, constituyen un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el grupo uronio al que están unidos, y

R9 representa un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido que incluye el átomo de nitrógeno al que está unido, y

Xes un anión;

ii) poner en contacto la mezcla y la sal de guanidinio o la sal de uronio obteniendo un compuesto marcador carboxilado activado;

iii) poner en contacto el compuesto marcador carboxilado activado con la biomolécula obteniendo una biomolécula marcada con el compuesto marcador carboxilado en el que el compuesto marcador carboxilado es un compuesto luminiscente que contiene un resto carboxílico.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha operación ii) se realiza a una temperatura de entre 0 y 60 °C durante un periodo de tiempo de hasta 60 minutos.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicha operación iii) se realiza a una temperatura de entre 4 y 50 °C durante un periodo de tiempo de hasta 24 horas.

Figura 1

Figura 2