Instrumento para detectar bacterias, método de detectar bacterias y kit para detectar bacterias.

Un dispositivo de detección de bacterias para detectar e identificar bacterias que pertenecen al géneroBacillus y/o especies de Bacillus en una muestra de prueba,

en donde un oligonucleótido que consiste en unasecuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidosde SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 entrelas secuencias de nucleótidos correspondientes a un gen de ARN ribosómico de 16S de bacterias a las quese dirige la detección, se inmovilizan en un sustrato; en donde dicho dispositivo de detección de bacterias espara detectar e identificar dichas bacterias en una muestra de prueba mediante hibridación entre eloligonucleótido y un ácido nucleico derivado de la muestra de prueba.

Instrumento para detectar bacterias, método de detectar bacterias y kit para detectar bacterias

Campo técnico

La presente invención se refiere a un dispositivo de detección de baterías, un método de detección de bacterias y un kit de detección de bacterias. Más en particular, la presente invención se refiere a un dispositivo de detección de bacterias en el que un oligonucleótido específico para bacterias aerobias formadoras de esporas, se inmoviliza sobre un sustrato; un método de detección de bacterias extremadamente preciso y fácilmente operable; y un kit de detección de bacterias que usa este dispositivo.

Antecedentes técnicos Se han investigado y desarrollado varias tecnologías con respecto al control sanitario en la industria alimenticia desde el punto de vista de la seguridad de los alimentos producidos. La seguridad de los alimentos en particular se ha convertido en un objeto de escrutinio estricto en años recientes, y hay un interés creciente en la mejora de la tecnología.

El control microbiológico es esencial para la implementación del control sanitario en las instalaciones de producción de alimentos. Para lograr esto, es necesario ensayar e identificar microorganismos. Puesto que el ensayo y la identificación de microorganismos requieren conocimiento y técnica especializados, habitualmente se encargan a varias instituciones o departamentos especializados. Las instituciones encargadas y demás llevan a cabo ensayos e identificación de microorganismos clasificándolos en base a las propiedades fisiológicas y bioquímicas así como a análisis genéticos.

El factor más importante en el control microbiano de los alimentos es proporcionar resultados de ensayos precisos para las instalaciones de producción de alimentos tan rápido como sea posible. Sin embargo, los métodos de ensayo, clasificación e identificación típicamente usados actualmente requieren varios días para identificar especies microbianas, y la identificación de un microorganismo, por ejemplo, habitualmente tarda de aproximadamente varios días a una semana. Por consiguiente, hay una fuerte necesidad para el desarrollo de un método de ensayo microbiano rápido y preciso que se pueda llevar a cabo en las instalaciones de producción de alimentos.

Las especies de Bacillus (bacterias que pertenecen al género Bacillus) y otras bacterias aerobias que forman esporas, en particular están ampliamente distribuidas en toda la naturaleza en la tierra, agua y aire, y se sabe que muchas de estas especies son dañinas. Por ejemplo, entre las especies de Bacillus, Bacillus anthracis y Bacillus cereus, que son microorganismos causantes de intoxicación alimentaria, se sabe que demuestran patogenicidad en seres humanos.

Ejemplos conocidos de métodos para clasificar e identificar bacterias incluyen métodos basados en propiedades fisiológicas y bioquímicas, métodos basados en la composición de quinona, composición de ácidos grasos de hongos y componentes de la pared celular, métodos basados en el contenido en G+C del ADN, métodos basados en homología de ADN, métodos que usan una sonda de ADN, y métodos que implican el análisis de las secuencias nucleotídicas de los genes del ARN ribosómico de 16S. Recientemente en particular, se está haciendo crecientemente común clasificar e identificar bacterias usando como indicadores grupos (clústeres) obtenidos por la clasificación sistemática basada en las secuencias nucleotídicas de los genes del ARN ribosómico de 16S.

Además, se divulga un ejemplo conocido de una tecnología para identificar bacterias que pertenecen a las bacterias aerobias que forman esporas en la patente japonesa número JP 9094100 (fecha de publicación: 8 de abril, 1997, documento de patente 1) y Shida, O. et al., Proposal for Two New Genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov., International Journal of Systematic Bacteriology, 939-946 (1996) (documento no patente 1) . En esta tecnología, se aplica PCR usando ADN que tiene una secuencia de nucleótidos específica presente en un gen de ARN ribosómico de 16S que pertenece a bacterias aerobias que forman esporas tales como las especies de Brevibacillus, Aneurinibacillus y Paenbacillus como cebador, y usando ADN cromosómico obtenido de las bacterias que se van a identificar como molde, seguido por la identificación de las bacterias que se van a identificar a nivel de género usando la amplificación de un ADN específico como indicador.

Además, se divulga una tecnología conocida para identificar bacterias de especies de Bacillus que utiliza genes de ARN ribosómico de 16S en Goto, K. et al., Application of the partial 16S rDNA sequence as an index for rapid identification of species in the genus Bacillus, The Journal of General and Applied Microbiology, 46, 1-8 (2000) (documento no patente 2) . Puesto que una región de aproximadamente 275 pb en el extremo 5’ de los genes de ARN ribosómico de 16S denominada la región hipervariable (HV) es una región específica de especie, esta tecnología puede clasificar bacterias de especies de Bacillus analizando la secuencia de nucleótidos de esta región.

Wilson et al. (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 68, no. 5, 1 de mayo, 2002, páginas 2535-2541) divulga una micromatriz con sondas dirigidas a ARNr para

detectar ácidos nucleicos de Bacillus. El documento JP2003284559 (NASU MASAO; INT REAGENTSCORP) divulga la detección de bacterias, por ejemplo, Bacillus cereus, con una matriz que comprende sondas dirigidas a ARNr de 16S. Liu et al (ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY OCT 2001, vol. 3, no. 10, Octubre 2001, páginas 619-629) divulga una matriz con sondas dirigidas a ARNr de 16S para detectar diferentes especies de Bacillus.

Divulgación de la invención Sin embargo, cada una de las tecnologías mencionadas anteriormente tiene dificultades en identificar rápida y fácilmente microorganismos en instalaciones de producción de alimentos. Por consiguiente, hay un deseo para el desarrollo de tecnología que se pueda usar en ensayos antes del transporte y demás en la industria de alimentos para la que hay una necesidad particular para ensayos rápidos.

Más específicamente, el método divulgado en el documento de patente 1 y el documento no patente 1 anteriormente mencionados es inherentemente no una tecnología para su uso en ensayos antes del transporte y demás en la industria de alimentos, sino más bien pone el énfasis en la identificación misma de las bacterias. Por consiguiente, en este método, aunque se asegura la velocidad debido al uso de PCR para la detección, ya que es un método específico de género, es necesario emplear un cebador correspondiente a cada género, lo que hace así el procedimiento complejo.

Además, el método descrito en el documento no patente 2 aún es inadecuado en térmicos de velocidad y simplicidad.

Puesto que se puede utilizar un método de identificación de microorganismos rápido y simple no solo en las instalaciones de producción de alimentos, sino también en la producción de fármacos y en hospitales, instalaciones de investigación y demás, hay una necesidad para el desarrollo de tal tecnología. Sin embargo, este tipo de tecnología hasta ahora no se ha conocido.

Con los problemas anteriores a la vista, un objeto de la presente invención es proporcionar una tecnología capaz de identificar no solo el género, sino también la especie de bacterias aerobias que forman esporas, al tiempo que también permiten la identificación rápida y simple de las mismas.

Como resultado de estudios extensos para resolver los problemas mencionados anteriormente, los inventores de la presente invención han encontrado una secuencia específica a un género específico o una especie específica en secuencias de nucleótidos correspondientes a genes de ARN ribosómico de 16S de bacterias contaminantes típicas de bebidas refrescantes y otros alimentos, y también han encontrado que las bacterias diana se pueden detectar e identificar tanto rápida como precisamente mediante hibridación con un ácido nucleico derivado de una muestra de prueba usando un dispositivo en el que se inmoviliza un oligonucleótido basado en esta secuencia de nucleótidos sobre un sustrato, lo que lleva a la conclusión de la presente invención.

Según esto, la presente invención incluye las invenciones descritas a continuación.

(1) Un dispositivo de detección de bacterias para detectar e identificar bacterias que pertenecen al género Bacillus y/o especies de Bacillus en una muestra de prueba, en donde un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de detección de bacterias para detectar e identificar bacterias que pertenecen al género Bacillus y/o especies de Bacillus en una muestra de prueba, en donde un oligonucleótido que consiste en una 5 secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 entre las secuencias de nucleótidos correspondientes a un gen de ARN ribosómico de 16S de bacterias a las que se dirige la detección, se inmovilizan en un sustrato; en donde dicho dispositivo de detección de bacterias es para detectar e identificar dichas bacterias en una muestra de prueba mediante hibridación entre el

oligonucleótido y un ácido nucleico derivado de la muestra de prueba.

2. El dispositivo de detección de bacterias según la reivindicación 1, en donde el dispositivo comprende además:

(a) al menos uno de los oligonucleótidos que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 10 15 u 11, para la detección de Bacillus cereus; y

(b) al menos uno de los oligonucleótidos que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, 43 o 44, para la detección de Bacillus sporothermodurans.

3. El dispositivo de detección de bacterias según la reivindicación 1 o 2, en donde el dispositivo tiene un grupo carbodiimida o un grupo isotiocianato en el sustrato, y se forma un enlace covalente como resultado de una reacción entre el grupo carbodiimida o el grupo isotiocianato y el oligonucleótido o un enlazador añadido a un extremo del oligonucleótido.

4. Un método de detección de bacterias para detectar e identificar bacterias que pertenecen al género Bacillus 25 y/o especies de Bacillus en una muestra de prueba, que comprende los pasos de:

preparar un ácido nucleico de las bacterias en la muestra de prueba;

preparar una sonda marcada usando el ácido nucleico como molde;

hibridar la sonda marcada con un oligonucleótido inmovilizado en un sustrato usando el dispositivo de 30 detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

detectar un señal de hibridación.

5. El método de detección de bacterias según la reivindicación 4, en donde la muestra de prueba es un alimento.

6. El método de detección de bacterias según la reivindicación 5, en donde el alimento es una bebida.

7. El método de detección de bacterias según la reivindicación 6, en donde el alimento es una bebida refrescante.

8. Un kit de detección de bacterias para llevar a cabo el método de detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el kit comprende el dispositivo de detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.