Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus.

Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus,

que comprende las etapas que consistenen:

• poner en contacto, en un recipiente, una muestra susceptible de contener bacterias del grupo Bacillus cereus,un medio de reacción que comprende al menos un sustrato fluorescente de PC-PLC y un inhibidor debacterias Gram negativas;

• incubar el conjunto;

• identificar las bacterias del grupo Bacillus cereus por detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PCPLC;caracterizado porque el pH del medio de reacción y el tiempo necesario para la detección de la reacción de hidrólisisdel sustrato de PC-PLC utilizado, están adaptados de tal modo que dicha reacción de hidrólisis por las bacterias delgrupo Bacillus cereus es detectada antes de que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Grampositivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, nopueda detectarse.

Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus La presente invención se refiere al campo del control microbiológico alimentario. Más particularmente, se basa en un método de discriminación de bacterias del grupo Bacillus cereus con respecto a otras bacterias, por hidrólisis de un sustrato fluorescente de lecitinasa o fosfatidilcolina fosfolipasa C, que se denomina en lo sucesivo PC-PLC.

El control microbiológico en el campo agroalimentario requiere la utilización de técnicas que permitan la detección y/o la identificación y/o la enumeración de microorganismos, . y que la obtención de resultados con ellas sea lo más rápido posible. Dichos microorganismos pueden ser no patógenos, por ejemplo bacterias de interés tecnológico tales como los fermentos o tales como los indicadores de calidad; estos últimos permiten validar el proceso de producción, materias primas o productos crudos, llegando hasta productos terminados. Sin embargo, dichos microorganismos son con frecuencia patógenos y la detección rápida y precisa de contaminaciones supuestas exige llevar a cabo acciones correctivas. Alternativamente, las toxinas producidas por dichos microorganismos y que son responsables de los efectos patógenos, pueden ser investigadas.

El diagnóstico clínico utiliza las mismas técnicas : o bien la detección y/o la enumeración de las propias bacterias. o bien la detección de las toxinas. En todos los casos, los factores importantes para los ensayos diagnósticos son la sensibilidad, la selectividad y el tiempo de obtención de los resultados.

El género Bacillus comprende bacterias Gram positivas presentes en la naturaleza en todas partes:: en la tierra, en el agua y en el aire, así como en los productos alimentarios, granos de cereales, leches en polvo, productos harinosos, especias etc. La capacidad de formar esporas las confiere una resistencia muy grande en el medio exterior. Las esporas de Bacillus cereus (B. cereus) , en particular, pueden contaminar los alimentos, materias primas y productos manufacturados. La supervivencia de dichas esporas se mantiene a todo lo largo de la cadena alimentaria. En circunstancias normales, el B. cereus está presente en una cantidad inferior a 103 células por gramo de alimento y carece de incidencia patógena, El nivel mínimo patógeno es superior a 105 células por gramo de alimento. La contaminación de un individuo a partir de un alimento puede ser responsable, por tanto, de una gastroenteritis. Las gastroenteritis asociadas con B. cereus se traducen o bien en vómitos, o bien en diarreas. Diversos alimentos pueden estar involucrados; carnes, arroz, platos deshidratados, salsas, sopas, etc. También pueden observarse infecciones oportunistas por B. cereus en pacientes debilitados tales como sujetos alcohólicos, inmunodeprimidos, o como consecuencia de heridas tales como quemaduras.

La detección y determinación cuantitativa de las bacterias del grupo Bacillus cereus es, por tanto, fundamental para los laboratorios de garantía de calidad de la industria agroalimentaria, así como para los laboratorios de diagnóstico clínico. Normalmente, el aislamiento se lleva a cabo en medios de cultivo selectivos, convencionales, en placa, por ejemplo las normas de tipo ISO (International Organization for Standardization) o los métodos BAM-FDA (Bacteriological Analytical Manual of the Food and Drug Administrarion) que recomiendan medios tales como el Agar-azul de bromotimol-manitol-yema de huevo-polimixina (PEMBA) o el Agar-polimixina-yema de huevo-manitol (MYP) según sus denominaciones anglosajonas. La identificación se lleva a cabo según las características morfológicas y las de los cultivos, o características metabólicos..

Estos medios PEMBA o MYP pueden dar lugar a falsos positivos potenciales asociados a un sistema inhibidor poco eficaz, o a falsos negativos, asociados con la ausencia posible de las características citadas, morfológicas o metabólicas, de ciertas cepas. Finalmente, ciertas cepas presentan reacciones ambiguas, tales como ha sido descrito por Fricker et al., International Journal of Food Microbiology; 121 (2008) : 27-34. Han sido desarrollados medios cromógenos en placa para paliar los falsos negativos. Estos medios contienen sustratos naturales o sustratos sintéticos cromógenos. De este modo son detectadas actividades enzimáticas especificas de ciertas cepas mediante la selección de estos sustratos. La especificidad de la detección puede mejorarse mediante la adición al medio de cultivo de sistemas inhibidores, mezclas de compuestos antimicrobianos y/o antifúngicos destinadas a limitar el crecimiento de otros microorganismos. No obstante, las mezclas de inhibidores retardan igualmente el crecimiento de microorganismos considerados dianas, en la medida en que están destinados a limitar el crecimiento de microorganismos del mismo género que dichos microorganismos considerados dianas .

Medios cromógenos o fluorescentes basados en la detección de la actividad de la fosfolipasa C específica del fosfatidilinositol (en lo sucesivo denominada PI-PLC) , han sido descritos en las patentes US 6.284.517 B, EP 1 219 628 B y US 6.558.917 B, así como en la publicación de Fricker et al., 2008 (referencia bibliográfica anterior) . Estos medios presentan el inconveniente de dar lugar a falsos negativos, en particular con ciertas cepas del grupo Bacillus cereus que no presentan actividad PI-PLC (B. cereus, B. mycoides, B. weihenstephanensis) o que presentan pequeña actividad PI-PLC (B. anthracis) , o a falsos positivos. Además, el sustrato fluorescente 4MU-MIP (4-metilumbeliferil-mioinositol-1 fosfato) presenta una estabilidad reducida en medio acuoso lo que impone condiciones excesivamente rigurosas para su utilización, en particular una medida discontinua de la fluorescencia llevada a cabo en condiciones precisas de pH según indica la patente US 6.558.917. Más propiamente, . es necesario realizar el cultivo a pH ácido y después alcalinizar el medio para aumentar la fluorescencia., leída en el punto final. La patente US 7.309.580 B2 describe un medio en placa de cultivo que combina un sustrato cromógeno de PC-PLC y un sustrato cromógeno de PI-PLC. Los colores respectivos, del medio, del primer sustrato y del segundo sustrato, son diferentes y pueden igualmente diferenciarse del tercer color que resulte de la mezcla posible de los productos procedentes de reacciones enzimáticas.

El medio BCM, suministrado por Biosynth® (Suiza) utiliza un sustrato cromógeno de PI-PLC y un sistema inhibidor de la flora bacteriana no considerada diana, que comprende polimixina B, trimetoprima, sulfametoxazol y cicloheximida. Los comportamientos del ensayo están mejorados con respecto a los medios estándar, pero ciertas cepas atípicas pueden quedar mal identificadas (Fricker et al., 2008, referencia anterior) .

Existen medios cromógenos que se basan en la hidrólisis de sustratos de 1-glucosidasa tales como el Brilliance ™ Bacillus cereus Agar suministrado por Oxoid™. No obstante, este medio genera falsos positivos Gram positivos a pesar de la presencia de un sistema inhibidor anti-Gram positivos que comprende polimixina B y trimetoprima, así como también falsos negativos (Fricker et al., 2008) .

Finalmente, existe un medio cromógeno en placa, que se basa en la hidrólisis de un sustrato cromógeno de PC-PLC: R&F® Anthracis Chromogenic Agar. Este medio proporciona una indicación de resultado negativo para el Bacillus anthracis en 24 horas y un resultado potencialmente positivo en 48 horas. El tiempo de obtención del resultado es largo y la especificidad necesita la presencia de varios antibióticos. (Juergensmeyer et al., Journal of food protection; vol. 69, No. 8 (2006) : 2002-2006, así como la patente US 2004/005652, describen igualmente la utilización de tales medios cromógenos.)

Resulta de este estado de la técnica que hasta la fecha no existe un procedimiento que permita detectar y/o enumerar bacterias del grupo de Bacillus cereus con ayuda de un medio de reacción que comprende un inhibidor de bacterias Gram negativas y un sustrato fluorescente de PC-PLC, cuyo medio de reacción permita obtener un resultado en 6 a 30 horas. Un procedimiento tal presenta un valor real añadido para el diagnóstico clínico o industrial, en particular en el campo de la industria agroalimentaria.

Teniendo en cuenta los inconvenientes manifestados en el estado de la técnica considerado anteriormente, los objetivos esenciales de la presente invención son:

• obtener un resultado positivo más rápidamente que con los ensayos existentes;

• reducir el número de falsos positivos;

• mejorar la sensibilidad, en particular para niveles pequeños de contaminación de la muestra, gracias... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus, que comprende las etapas que consisten en:

• poner en contacto, en un recipiente, una muestra susceptible de contener bacterias del grupo Bacillus cereus, un medio de reacción que comprende al menos un sustrato fluorescente de PC-PLC y un inhibidor de bacterias Gram negativas;

• incubar el conjunto;

• identificar las bacterias del grupo Bacillus cereus por detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-

PLC; caracterizado porque el pH del medio de reacción y el tiempo necesario para la detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-PLC utilizado, están adaptados de tal modo que dicha reacción de hidrólisis por las bacterias del grupo Bacillus cereus es detectada antes de que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Gram positivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, no pueda detectarse.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el pH del medio de reacción está comprendido entre 6, 8 y 8, 0.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tiempo necesario para la detección de la hidrólisis del sustrato de PC-PLC, está comprendido entre 6 y 30 horas.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de reacción está en forma líquida, de gel o sólida.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de reacción es un medio de cultivo.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa previa de enriquecimiento de la muestra.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio comprende, además, al menos un segundo sustrato, cromógeno o fluorescente.

8. Procedimiento según la reivindicación precedente, en el que el segundo sustrato es un sustrato de PI-PLC que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus mycoides y Bacillus pseudomycoides.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es igualmente posible una enumeración de las bacterias del grupo Bacillus cereus.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el recipiente está tomado del grupo constituido por microplacas, microcúpulas, microtubos, capilares o placas de muchos pocillos.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato fluorescente de PC-PLC corresponde al 4 MU-CP (4-metil-umbeliferil-colina fosfato)

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las bacterias del grupo Bacillus cereus están escogidas entre Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis, y las otras bacterias están escogidas entre Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus o las otras especies del género Bacillus spp. tales como Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus circulans, Bacillus lentus, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium y Paenibacillus polymyxa.

13. Kit de diagnóstico que permite la utilización del procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, y que comprende un medio de reacción selectivo o no, cuyo medio comprende al menos un inhibidor de bacterias Gram negativas y un sustrato fluorescente de PC-PLC.

14. Kit de diagnóstico según la reivindicación precedente, que comprende, además, un recipiente, tomado del grupo constituido por microplacas, microcúpulas, microtubos, capilares y placas de muchos pocillos.

15. Kit de diagnóstico según una de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que el sustrato fluorescente de PC-PLC corresponde al 4 MU-CP (4-metil-umbeliferil-colina fosfato) .

16. Kit de diagnóstico según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el medio de reacción comprende, además, al menos un segundo sustrato, cromógeno o fluorescente.

17. Kit de diagnóstico según la reivindicación 16, en el que el segundo sustrato es un sustrato de PI-PLC que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus mycoides y Bacillus pseudomycoides.