Humanización de anticuerpos.

Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas,

produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.

Humanización de anticuerpos

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de modificación por reingeniería o remodelación de anticuerpos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos, al tiempo que se mantiene la inmunoespecificidad de los anticuerpos para un antígeno. En particular, la presente invención proporciona métodos de producción de anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno sintetizando una biblioteca combinatoria que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo donador fusionado en marco con regiones de entramado de un sub-banco de regiones de entramado.

1. Antecedentes de la invención Los anticuerpos desempeñan un papel fundamental en nuestras respuestas inmunitarias. Pueden inactivar virus y toxinas bacterianas y son esenciales en el reclutamiento del sistema del complemento y diversos tipos de glóbulos blancos para destruir microorganismos invasores y parásitos grandes. Los anticuerpos se sintetizan exclusivamente por linfocitos B y se producen en millones de formas, cada una con una secuencia de aminoácidos diferente y un sitio de unión diferente para un antígeno. Los anticuerpos, denominados colectivamente inmunoglobulinas (Ig) , están entre los componentes de proteínas más abundantes en la sangre. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

Un anticuerpo típico es una molécula en forma de Y con dos cadenas pesadas (H) idénticas (que contienen cada una aproximadamente 440 aminoácidos) y dos cadenas ligeras (L) idénticas (que contienen cada una aproximadamente 220 aminoácidos) . Las cuatro cadenas se mantienen juntas mediante una combinación de enlaces no covalentes y covalentes (disulfuro) . Las enzimas proteolíticas, tales como papaína y pepsina, pueden dividir una molécula de anticuerpo en diferentes fragmentos característicos. La papaína produce dos fragmentos Fab idénticos y separados, cada uno con un sitio de unión a antígeno, y un fragmento Fc. La pepsina produce un fragmento F (ab’) 2. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

Tanto las cadenas L como H tienen una secuencia variable en sus extremos amino-terminales pero una secuencia constante en sus extremos carboxilo-terminales. Las cadenas L tienen una región constante de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y una región variable del mismo tamaño. Las cadenas H también tienen una región variable de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, pero la región constante de las cadenas H tiene aproximadamente 330 ó 440 aminoácidos de longitud, dependiendo de la clase de la cadena H. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc. en la pág. 1019.

Sólo parte de la región variable participa directamente en la unión del antígeno. Estudios han mostrado que la variabilidad en las regiones variables tanto de las cadenas L como H está limitada en su mayor parte a tres regiones hipervariables pequeñas (también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR) en cada cadena. Las partes restantes de la región variable, conocidas como regiones de entramado (FR) , son relativamente constantes. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc. en las págs. 1019 1020.

Se han usado inmunoglobulinas naturales en ensayos, diagnósticos y, en una medida más limitada, terapia. Sin embargo, tales usos, especialmente en terapia, se han visto dificultados por la naturaleza policlonal de inmunoglobulinas naturales. La llegada de anticuerpos monoclonales de especificidad definida aumentó las oportunidades para uso terapéutico. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos monoclonales se producen tras la inmunización de un animal huésped roedor con la proteína diana y la posterior fusión de una célula del bazo de roedor que produce el anticuerpo de interés con una célula de mieloma de roedor. Por tanto, son esencialmente proteínas de roedor y como tales son naturalmente inmunogénicas en seres humanos, dando con frecuencia lugar a una respuesta inmunitaria no deseada denominada respuesta HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) .

Muchos grupos han ideado técnicas para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos. Tradicionalmente, se selecciona un molde humano mediante el grado de homología con el anticuerpo donador, es decir, se usa el anticuerpo humano más homólogo con el anticuerpo no humano en la región variable como molde para la humanización. El fundamento es que las secuencias de entramado sirven para mantener las CDR en su orientación espacial correcta para la interacción con un antígeno, y que a veces los residuos de entramado pueden incluso participar en la unión a antígeno. Por tanto, si las secuencias de entramado humanas seleccionadas son las más similares a las secuencias de las regiones de entramado donadoras, se maximizará la probabilidad de que se conserve la afinidad en el anticuerpo humanizado. Winter (documento EP n.º 0239400) , por ejemplo, propuso generar un anticuerpo humanizado mediante mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos largos con el fin de injertar tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de cada una de las regiones 65 variables de cadena pesada y ligera. Aunque se ha mostrado que este enfoque funciona, limita la posibilidad de seleccionar el mejor molde humano que soporta las CDR donadoras.

Aunque un anticuerpo humanizado es menos inmunogénico que su equivalente natural o quimérico en un ser humano, muchos grupos encuentran que un anticuerpo humanizado con CDR injertada puede demostrar una disminución significativa de la afinidad de unión (por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 3 32:323-327) . Por

ejemplo, Reichmann y colaboradores encontraron que la transferencia de las regiones CDR sola no era suficiente para proporcionar una actividad de unión a antígeno satisfactoria en el producto con CDR injertada, y que también era necesario convertir un residuo de serina en la posición 27 de la secuencia humana en el correspondiente residuo de fenilalanina de rata. Estos resultados indicaron que pueden ser necesarios cambios en los residuos de la secuencia humana fuera de las regiones CDR para obtener una actividad de unión a antígeno eficaz. Aún así, la afinidad de unión todavía era significativamente inferior a la del anticuerpo monoclonal original.

Por ejemplo, Queen et al (patente estadounidense n.º 5.530.101) describieron la preparación de un anticuerpo humanizado que se une al receptor de interleucina-2, combinando las CDR de un anticuerpo monoclonal murino (mAb anti-Tac) con regiones de entramado y constantes de inmunoglobulina humana. Las regiones de entramado humanas se eligieron para maximizar la homología con la secuencia de mAb anti-Tac. Además, se usó modelado por ordenador para identificar residuos de aminoácido de entramado que era probable que interaccionaran con las CDR o antígeno, y se usaron aminoácidos de ratón en estas posiciones en el anticuerpo humanizado. Se notificó que el anticuerpo anti-Tac humanizado obtenido tenía una afinidad por el receptor de interleucina-2 (p55) de 3 X 109 M-1, lo que todavía era de tan sólo aproximadamente un tercio de la del mAb murino.

Otros grupos identificaron posiciones adicionales dentro de la secuencia de entramado de las regiones variables (es decir, fuera de las CDR y bucles estructurales de las regiones variables) en las que las identidades de aminoácido de los residuos pueden contribuir a obtener productos con CDR injertada con afinidad de unión satisfactoria. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.054.297 y 5.929.212. Además, es imposible saber de antemano lo eficaz que será una disposición de injerto de CDR particular para cualquier anticuerpo de interés dado.

Leung (publicación de solicitud de patente estadounidense n.º US 2003/0040606) describe un enfoque de parches de entramado, en el que la región variable de la inmunoglobulina se compartimentaliza en FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, y se selecciona la secuencia de FR individual mediante la mejor homología entre el anticuerpo no humano y el molde de anticuerpo humano. Sin embargo, este enfoque requiere mucho trabajo y no pueden identificarse fácilmente las regiones de entramado óptimas.

Dado que están desarrollándose más anticuerpos terapéuticos y tienen resultados más prometedores, es importante poder reducir o eliminar la respuesta inmunitaria del organismo provocada por el anticuerpo administrado. Por tanto,

nuevos enfoques que permiten un diseño por ingeniería eficaz y rápido de anticuerpos para que sean de tipo humano y/o que permiten una reducción del... [Seguir leyendo]

1. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de 5 dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.

2. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.

3. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende: (i) un primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de 35 dicho primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, y (ii) un segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dicho segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia 45 de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR de región variable de cadena pesada se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano, las CDR de región variable de cadena ligera se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano, cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican 55 para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena ligera humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende además introducir la biblioteca combinatoria de secuencias de nucleótidos en una población de células.

5. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena 5 pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia 10 de ácido nucleico de región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una una secuencia de polinucleótido que codifica para una región variable de cadena ligera; y (c) expresar las secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.

6. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada 20 una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de 25 ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una una secuencia de polinucleótido que codifica para una región variable de cadena pesada y (c) expresar las secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.

7. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de primeras secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico 40 que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico 45 que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de 50 anticuerpos humanos funcionales; (b) sintetizar una pluralidad de segundas secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de 55 entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y 60 cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (c) introducir las secuencias de ácido nucleico generadas en las etapas (a) y (b) en una población de células; y (d) expresar las secuencias de nucleótidos que codifican para la región variable de cadena 65 pesada y la región variable de cadena ligera.

8. Método según la reivindicación 5, 6 ó 7, que comprende además, tras la etapa de expresar las secuencias de nucleótidos, la etapa de examinar para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno.

9. Método según la reivindicación 5, 6, 7 u 8, que comprende además, antes de la etapa (a) , la etapa de generar los 5 sub-bancos de secuencias de región de entramado.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los sub-banco (s) de región de entramado humana comprende (n) regiones de entramado de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales en las que se han introducido una o mutaciones.