Huella proteómica para el diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis.

Un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas,

que comprende:

a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia de los niveles de dichas 10 proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas,

en donde,

(i) si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen y

(ii) si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y variantes son mayores que los valores de 20 referencia para cada una de dichas proteínas, o genes entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

Huella proteómica para el diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis

Campo de la invención La invención se refiere al campo de la farmacoproteómica y, más en particular, a una firma proteómica formada por una colección de biomarcadores para la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis. Dichos biomarcadores se pueden usar en métodos para diagnosticar EHNA y/o esteatosis, más específicamente para el diagnóstico temprano de EHNA y/o esteatosis, así como en métodos para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA y/o esteatosis, y para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dichas afecciones.

Antecedentes de la invención Los países occidentales representan una población de más de 200 millones de personas que padecen obesidad, por tanto considerados en riesgo de desarrollar una enfermedad hepática grasa no alcohólica (EHGNA) . EHGNA es un término clinicopatológico que incluye trastornos que varían desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) a la esteatosis hepática con inflamación (esteatohepatitis no alcohólica o EHNA) .

El hígado graso, también denominado esteatosis hepática, se define como una acumulación excesiva de grasa en los hepatocitos. La esteatosis hepática implica la acumulación de triglicéridos en los hepatocitos, necrosis de hepatocitos, inflamación, obstrucción de pequeñas venas hepáticas y con frecuencia fibrosis con algunas veces evolución a cirrosis, cáncer hepatocelular y muerte de origen hepático (El-Serag H B, et al. Gastroenterology 2004;

126: 460-468, Dam-Larsen S, et al. Gut 2004; 53: 750-5) .

La prevalencia mundial de la esteatosis hepática es muy alta, se asocia con varios factores tales como alcohol, diabetes, sobrepeso, hiperlipidemia, resistencia a insulina, hepatitis C de genotipo 3, abetalipoproteinemia y algunos fármacos (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132: 112-7; Levitsky J, Mailliard M E. Semin. Liver Dis. 2004;

24: 233-47) . Sin embargo, no hay recomendación estándar para el diagnóstico de la esteatosis hepática. La recomendación normal es medir GGT y ALT y realizar biopsia de hígado para la clasificación y determinación de fases (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132: 112-7; Levitsky J, Mailliard M E. Semin. Liver Dis. 2004; 24: 233-47; Bravo A A, et al. N. Engl. J. Med. 2001: 344; 495-500) . Puesto que la biopsia hepática todavía es un procedimiento invasivo y caro, con errores potenciales de muestreo, es ventajoso tener una prueba que de un buen valor predictivo del nivel de esteatosis hepática en un sujeto.

La solicitud de patente internacional WO2006/082500 divulga un método para el diagnóstico de la esteatosis hepática en un sujeto, que comprende estudiar 5 marcadores bioquímicos midiendo los valores de sus concentraciones en el suero o plasma de dicho sujeto. Dichos marcadores son: ApoA1 (apolipoproteína A1) , alfa.2macroglobulina, ALT (alanina aminotransferasa) , GGT (gamma glutamil transpeptidasa) y triglicéridos.

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos, daño a los hepatocitos e inflamación que recuerda a la hepatitis alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde la esteatosis hepática a la cirrosis e insuficiencia hepática. Unos antecedentes cuidadosos de la falta de ingesta de alcohol es esencial para establecer este diagnóstico. EHNA es una de las causas más comunes de aminotransferasas elevadas en sujetos remitidos para evaluación a los hepatólogos. La obesidad y la diabetes de tipo 2 están asociadas a EHNA. Dado que la prevalencia de estas enfermedades está en aumento, también se espera que la prevalencia de EHNA aumente y por lo tanto, esta enfermedad se ha convertido en un tema publico emergente en los Estados Unidos así como en otros países.

Se cree que EHNA surge de la interacción de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. La evaluación inicial de sujetos que se sospecha que padecen EHNA cuando están presentes, son fatiga y molestias en la zona abdominal superior derecha. La biopsia hepática está indicada en sujetos sintomáticos con aumentos en las aminotransferasas en suero de más de 6 meses de duración. Las características histológicas de EHNA, que son en la mayor parte indistinguibles de las de la hepatitis alcohólica, incluyen infiltración grasa macrovesicular, necrosis hepatocelular y degeneración por hinchamiento, hialina alcohólica y reacción inflamatoria.

Como es cierto para otras enfermedades complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en sujetos con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A (MAT1A-KO) . Aproximadamente a la edad de 3 meses, los hígados de MAT1A-KO tienen histología normal pero son más sensibles a desarrollar esteatosis grave. Estos ratones desarrollan de forma espontánea EHNA y carcinoma hepatocelular aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC, 2001, PNAS USA 98, 5560-5565]. El gen MAT1A codifica metionina adenosiltransferasa I y III, las principales enzimas responsables de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios anteriores concluyeron que los sujetos con cirrosis hepática y hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe; y que el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en sujetos con cirrosis hepática alcohólica.

La solicitud de patente internacional WO2008/021192 divulga un método para el diagnóstico, evaluación de la gravedad y/o evaluación de la progresión o regresión de un trastorno de hígado en un sujeto, tal como esteatosis hepática o EHNA. El método comprende determinar una cantidad de uno o más metabolitos lipídicos en muestras de un líquido corporal de un sujeto y correlacionar la (s) cantidad (es) de uno o más metabolitos lipídicos con la presencia del trastorno hepático.

El documento US 6631330 divulga conjuntos de marcadores, métodos y kits para diagnosticar y seguir la fibrosis hepática y/o la presencia de lesiones necroinflamatorias hepáticas en un paciente. Dicho método implica el estudio de al menos 4 marcadores bioquímicos seleccionados de α2-macroglobulina, AST (aspartato aminotransferasa) , ALT (alanina aminotransferasa) , GGT (gammaglutamil transpeptidasa) , γ-globulina, bilirrubina total, albúmina, α1globulina, α2-globulina, apoA1, IL-10, TGF-β1, Apo2 y apoB. Sin embargo, dicho documento no divulga marcadores útiles para el diagnóstico específico de EHNA.

Poynard Thierr y y col. (Poynard Thierr y et al., BMC Gastroenterology. 2006; 6 (1) :34) divulga un método de diagnóstico de EHNA/esteatosis que combina 13 parámetros: edad, sexo, altura, peso y niveles en suero de triglicéridos, colesterol, alfa 2 macroglobulina, apolipoproteína A1, haptoglobina, gamma-glutamil-transpeptidasa, transaminasas ALT, AST y bilirrubina total. Dicho método permite la discriminación entre pacientes que tienen EHNA y los que tienen esteatosis pero no EHNA. Sin embargo, dicho método no permite discriminar entre EHNA/esteatosis y otras enfermedades hepáticas.

El documento US 2007/037221 divulga marcadores y métodos para diagnosticar una patología hepática incluyendo hepatitis e hígado graso/esteatosis. El método divulgado en este documento se basa en la cuantificación de la glicosilación en proteínas marcadoras y la comparación de los valores obtenidos para la glicosilación de tales proteínas con valores de referencia en sujetos con y/o sin patologías hepáticas.

Santos-Gonzalez y col. (Santos-Gonzalez et al., Experimental Gerontology, 2007, 42 (8) :798-806) divulga que la alimentación de ratas con una dieta basada en coenzima 010 produce una expresión diferencial de hemopexina, apolipoproteína H, cadena pesada del inter-α-inhibidor H4P, preprohaptoglobina, precursor de la cadena gamma del fibrinógeno, proteína similar a fetuina, precursor de α-1-antitripsina, peroxirredoxina de tipo II, inhibidor 3 de serina proteasa, proteína de unión a vitamina D y ApoAl en plasma.

La solicitud de patente internacional WO2004/055520 divulga un método de diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) usando marcadores moleculares. El método consiste en detectar y cuantificar, in vitro en una muestra de tejido hepático, los niveles de una proteína que se puede usar como un marcador molecular de EHNA y que se selecciona de apolipoproteína A1, subunidad beta de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas, que comprende:

a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia de los niveles de dichas proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas,

en donde,

(i) si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen y

(ii) si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y variantes son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteínas, o genes

entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

2. Método según la reivindicación 1 que comprende además detectar y cuantificar en el paso (i) los niveles de apolipoproteína AI o del gen que codifica dicha proteína, en donde si dichos niveles son menores que los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar esteatosis.

3. Método según la reivindicación 1 que comprende además detectar y cuantificar en el paso (i) los niveles de fibrinógeno gamma o del gen que codifica dicha proteína, en donde si dichos niveles son menores que los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar EHNA.

4. Un método in vitro para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis, que comprende:

a) detectar y cuantificar los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso (a) con valores de referencia de los niveles de dichas proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas o,

en donde,

(i) si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia y

(ii) si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia entonces

la terapia administrada a dicho sujeto ha sido eficaz o está siendo eficaz.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende además detectar los niveles de la proteína apolipoproteína A1 o del gen que codifica dicha proteína en donde si dichos niveles son menores que un valor de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no ha sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de esteatosis.

6. Método según la reivindicación 4 que comprende además detectar los niveles de fibrinógeno gamma o del gen que codifica dicha proteína en donde si dichos niveles son menores que un valor de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no ha sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de EHNA.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la muestra es suero, plasma o suero o plasma donde se ha eliminado HSA.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los niveles de las proteínas se determinan mediante western blot, ELISA o electroforesis bidimensional y tinción.

9. Un kit que comprende un conjunto de reactivos, en donde dicho conjunto consiste en reactivos para detectar las proteínas antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o los genes que codifican dichas proteínas y, opcionalmente, un reactivo para detectar una proteína de mantenimiento o el gen que codifica dicha proteína de mantenimiento.

10. Kit según la reivindicación 9 que comprende además un reactivo para detectar la proteína apolipoproteína A1

o para detectar el gen que codifica dicha proteína.

11. Kit según la reivindicación 9 que comprende además un reactivo para detectar la proteína fibrinógeno gamma 15 o el gen que codifica dicha proteína.

12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el conjunto de reactivos se selecciona del grupo de:

a) Un conjunto de ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con los genes que codifican dichas proteínas y b) Un conjunto de anticuerpos, o fragmentos de los mismos capaces de unirse específicamente a dichas proteínas.

WESTERN BLOT