Hidrogeles de fibroína de seda y usos de éstos.

Una formulación de hidrogel de fibroína de seda en la que la formulación comprende:

a) una fase de gel, incluyendo la fase de gel partículas de hidrogel que comprenden una fibroína de sedasustancialmente desprovista de sericina y un péptido anfílico; y

b) una fase vehicularpara uso en un método de reconstrucción o aumento de tejido blando, comprendiendo el método la etapa de administrarla formulación a una región de tejido blando de un individuo que necesita reconstrucción o aumento de tejido blando.

Hidrogeles de fibroína de seda y usos de éstos Referencia cruzada Esta solicitud de patente reivindica prioridad conforme a 35 U.S.C. § 119 (e) a la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. de Serie 61/170.895 presentada el 20 de abril, 2009.

Campo de la invención La presente especificación describe fibroína de seda purificada y método para purificar fibroínas de seda, hidrogeles que comprenden fibroína de seda con o sin un péptido anfílico y métodos para preparar hidrogeles que comprenden fibroína de seda y el uso de hidrogeles de fibroína de seda en una variedad de usos médicos, incluyendo, sin limitación, rellenos para espacio tisular, moldes para la reconstrucción o regeneración de tejidos, soportes para células en aplicaciones de ingeniería de tejidos y para modelos de enfermedad, un recubrimiento superficial para mejorar la función de dispositivos médicos, o como una plataforma para la administración de fármacos.

Antecedentes Seda se refiere a un producto filamentoso secretado por un organismo tal como una araña o gusano de seda. La fibroína es el componente estructural principal de la seda. Está compuesta por unidades monoméricas que comprenden una cadena pesada de aproximadamente 350 kDa y una cadena ligera de aproximadamente 25 kDa, e intercalada en los monómeros de fibroína está otra proteína de aproximadamente 25 kDa derivada del gen P25. La proporción de cadena pesada:cadena ligera:proteína P25 es aproximadamente 6:6:1. La fibroína es secretada por las glándulas de la seda del organismo como una pareja de fibrillas complementarias denominadas "hebras". Al dejar las hebras de fibroína las glándulas, se recubren con sericina, una sustancia semejante al pegamento que une las hebras entre sí. Habitualmente, la sericina es antigénica y puede estar asociada con una reacción tisular adversa cuando la seda que contiene sericina se implanta in vivo.

Las fibras de seda del gusano de la seda disponibles tradicionalmente en el mercado comercial se denominan habitualmente "desgomadas", que se refiere a la relajación y eliminación de una parte de la cubierta de sericina que rodea las dos hebras de fibroína mediante lavado o extracción en agua jabonosa caliente. Esta seda desgomada contiene o esta recubierta habitualmente con sericina y otras impurezas con el fin de unir el multifilamento doblado entre sí en una única fibra. Por lo tanto, la seda desgomada, a no ser que se indique explícitamente lo contrario, contiene típicamente un veinte por ciento a veintiocho por ciento (en peso) de sericina y no puede asumirse que carezca de sericina.

Las fibras de seda se han apreciado históricamente en cirugía por sus propiedades mecánicas, particularmente en la forma de filamentos trenzados usados como material de sutura. La sericina residual que puede estar contenida en estos materiales permanece como un obstáculo potencial para su uso como un biomaterial ya que presenta la posibilidad de una respuesta inmune intensificada. Sin embargo, esta contaminación con sericina puede eliminarse sustancialmente, lo que resulta en una fibroína que virtualmente carece de sericina que puede usarse bien como fibras o disuelta y reconstituida de varias formas. Por ejemplo, la seda natural del gusano de seda Bombyx mori puede someterse a extracción de sericina, centrifugado en ovillos y usarse entonces para crear una matriz con una resistencia a la tracción adecuada para aplicaciones tales como ligamentos y tendones obtenidos por bioingeniería. El uso de materiales de seda regenerados también se ha propuesto para varios propósitos médicos incluyendo la protección de heridas, sustrato de cultivo celular, inmovilización de enzimas, lentillas blandas y agentes de liberación de fármacos.

Los dispositivos de fibroína de seda bien nativos, disueltos o reconstituidos, no contienen típicamente dominios de unión a células tales como los encontrados en el colágeno, fibronectina y muchas otras moléculas de la matriz extracelular (ECM) . La fibroína también es muy hidrofóbica debido a la red cristalina rica en láminas ! de la proteína fibroína central. Estos dos factores se unen para limitar severamente la capacidad de las células huésped nativas de unirse a e interaccionar con dispositivos de seda implantados, ya que ni las células inflamatorias como los macrófagos ni las células reparadoras como los fibroblastos son capaces de unirse fuertemente, infiltrarse y bioresorber los dispositivos de fibroína de seda. En el caso de la seda virgen y suturas de seda negras trenzadas (recubiertas con cera o silicona) , esto se manifiesta típicamente en una respuesta severa a cuerpo extraño caracterizada por la encapsulación periférica. La seda que sustancialmente carece de sericina experimenta una respuesta similar aunque sustancialmente menos vigorosa cuando se implanta. En esencia, las células huésped identifican la seda como un cuerpo extraño y optan por separarla con una pared en lugar de interaccionar con ella. Esto limita severamente el potencial a largo plazo posterior del dispositivo particularmente en lo que se refiere al crecimiento tisular hacia el interior y remodelado y potencialmente, la utilidad global del dispositivo. Si fuera posible proporcionar una formulación de biomaterial más eficaz para mediar las interacciones huésped-dispositivo mediante la cual se proporciona a las células una superficie reconocible, aceptable y por lo tanto biocompatible, se mejoraría dramáticamente la utilidad biológica, médica y quirúrgica de la seda.

Un posible medio para introducir esta interacción mejorada célula-material es alterar el formato del material fibroína de seda en una matriz más biocompatible. La manipulación de la fibroína de seda para prepararla en una formulación de hidrogel de seda es una opción particularmente interesante porque consiste en una red de proteína de seda que está completamente saturada con agua, acoplando la resiliencia molecular de la seda con la biocompatibilidad de un material "húmedo". La generación de un hidrogel de seda puede conseguirse brevemente rompiendo los polímeros de fibroína de seda nativa en sus componentes monoméricos individuales usando una especie de disolvente, reemplazando el disolvente con agua e induciendo una combinación de agregación inter e intra-molecular. Se ha mostrado que la transición sol-gel puede iniciarse selectivamente cambiando la concentración de la proteína, temperatura, pH y aditivo (por ejemplo, iones y polímeros higroscópicos tales como poli (etilen óxido) (PEO) , poloxámero y glicerol) . El incremento de la concentración de la seda y la temperatura puede alterar el tiempo que tarda la gelificación de la seda incrementando la frecuencia de interacciones moleculares, incrementando las posibilidades de la nucleación del polímero. Otro medio para acelerar la gelificación de la seda es mediante el uso de iones de calcio que pueden interaccionar con los bloques hidrofílicos en los extremos de las moléculas de seda en disolución antes de la gelificación. Se ha mostrado que la disminución del pH y la adición de un polímero hidrofílico aumentan la gelificación, posiblemente disminuyendo la repulsión entre las moléculas de seda individuales en disolución y posteriormente compitiendo con las moléculas de fibroína de seda en disolución para unir agua, causando la precipitación y agregación de la fibroína.

Se han producido otros geles de fibroína de seda, por ejemplo, mezclando una disolución acuosa de fibroína de seda con biomateriales derivados de proteína tales como gelatina o quitosán. Los materiales de proteínas recombinantes basados en la estructura de la fibroína de seda también se han usado para crear estructuras de hidrogel autoensambladas. Otro gel de seda, un gel fibroína de seda-poli- (vinil alcohol) se creó por liofilización o secado al aire de una disolución acuosa, reconstituyendo en agua y permitiendo que se auto-ensamblara. Los hidrogeles de seda también se han generado exponiendo la disolución de seda a una condición de temperatura de 40C (Thermgel) o añadiendo glicerol al treinta por ciento (v/v) (Glygel) . Los hidrogeles de seda creados mediante un proceso de congelación-descongelación no sólo se han generado sino que también se han usado in vitro como un soporte de cultivo celular.

El uso de hidrogeles de seda como matrices de biomateriales también se ha explorado de varias maneras. Se investigó la búsqueda general de hidrogeles como plataformas para administración de fármacos, específicamente el comportamiento de la liberación de benfotiamina (una variante sintética de la vitamina B1) acoplado con hidrogel de seda. El estudio reveló que tanto la concentración de seda como la adición de otros compuestos puede tenerse en cuenta en el perfil de liberación... [Seguir leyendo]

1. Una formulación de hidrogel de fibroína de seda en la que la formulación comprende:

a) una fase de gel, incluyendo la fase de gel partículas de hidrogel que comprenden una fibroína de seda sustancialmente desprovista de sericina y un péptido anfílico; y b) una fase vehicular para uso en un método de reconstrucción o aumento de tejido blando, comprendiendo el método la etapa de administrar

la formulación a una región de tejido blando de un individuo que necesita reconstrucción o aumento de tejido blando.

2. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden 1% (p/v) a 10% (p/v) de una fibroína de seda.

3. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que el péptido anfílico comprende un resto RGD.

4. La formulación para el uso de la reivindicación 3, en la que el péptido anfílico es 23 RGD.

5. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que el péptido anfílico comprende una región de cola, seguida de una región espaciadora y finalmente un resto RGD.

6. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden una proporción molar de 1:10 a 10:1 moles del péptido anfílico por mol de la fibroína de seda.

7. La formulación para el uso de la reivindicación 6, en la que las partículas de hidrogel comprenden una proporción molar de 3:1 moles del péptido anfílico por mol de la fibroína de seda.

8. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden una estructura proteica que tiene una conformación de lámina ! de al menos 80%.

9. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden una estructura proteica que tiene una conformación de lámina ! de al menos 50%.

10. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden una estructura proteica que tiene una conformación de lámina ! de al menos 20%.

11. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden una estructura proteica que tiene una conformación de hélice ∀ y espiral al azar como máximo del 20%.

12. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel tienen un área transversal de 5 #m2 a 1.000 #m2.

13. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel tienen un área transversal de 20 #m2 a 50 #m2.

14. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que la fase vehicular comprende salino.

15. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que la fase vehicular comprende una disolución de tensioactivo.

16. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que la fase de gel es 50% a 99% del volumen total de la formulación, siendo el resto una disolución vehicular.

17. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que la fase de gel es aproximadamente 75% del volumen total de la formulación, siendo el resto una disolución vehicular.

18. La formulación para el uso de la reivindicación 16, en la que la formulación de hidrogel comprende además lidocaína.

19. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que una molécula sintética que tiene la fórmula: (molécula X) n (péptido espaciador) 0-300- (cola peptídica de cinco aminoácidos) se conjuga con la fibroína de seda.

20. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que las partículas de hidrogel comprenden un componente celular.

21. La formulación para el uso de la reivindicación 20, en la que el componente celular comprende células madre.

22. La formulación para el uso de la reivindicación 20, en la que el componente celular comprende células adiposas.

23. La formulación para el uso de la reivindicación 20, en la que el componente celular comprende células madre y células adiposas.

24. La formulación para el uso de la reivindicación 1, en la que la región de tejido blando es tejido de mama.

25. Una formulación de hidrogel de fibroína de seda para uso en un método de reconstrucción de tejido blando, en la que la formulación comprende i) una fase de gel, incluyendo la fase de gel partículas de hidrogel que comprenden una fibroína de seda sustancialmente desprovista de sericina y un péptido anfílico; y

ii) una fase vehicular,

comprendiendo el método las etapas de a) situar un dispositivo médico implantable en un individuo en la localización deseada; b) expandir el dispositivo poniendo una formulación de hidrogel de fibroína de seda en el dispositivo.

26. Una formulación de hidrogel de fibroína de seda para uso en un método de reconstrucción o aumento de mama, en la que la formulación comprende a) una fase de gel, incluyendo la fase de gel partículas de hidrogel que comprenden una fibroína de seda sustancialmente desprovista de sericina y un péptido anfílico; y

b) una fase vehicular,

comprendiendo el método la etapa de la administración subdérmica de una formulación de hidrogel de fibroína de seda a una mama de un individuo que necesita reconstrucción o aumento de mama. 20