Glicoproteína inmunorreactiva gp19 de Ehrlichia canis.

Una composición, que comprende uno o más de los siguientes:

(a) un polipéptido aislado que consiste de SEQ ID NO:

13, o una parte inmunogénica del mismo; o

(b) un polipéptido aislado que es al menos 75% idéntico a SEQ ID NO: 13 y que tiene de 24 a 50 aminoácidos de longitud.

Glicoproteína inmunorreactiva gp19 de Ehrlichia canis La presente invención se hizo con aportes del National Institutes of Health R01 AI 071145-01 y 1 P41 RR018502-01. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

Campo de la invención La presente invención se relaciona al menos con los campos de la biología molecular, biología celular, patología y medicina, incluyendo medicina veterinaria. En otros aspectos, la presente invención se relaciona con composiciones inmunorreactivas de gp19 en E. canis.

Antecedentes de la invención La Ehrlichia canis es una bacteria intracelular obligadamente transmitida por garrapatas o piojos que produce enfermedades moderadas a severas y algunas veces fatales en cánidos salvajes y domésticos. Los genomas de E. canis y otros organismos del género, incluyendo E. chaffeensis y E. ruminantium, exigen un alto grado de sintonía genómica, familias proteínicas parálogas, una gran proporción de proteínas con hélices transmembrana y/o otras secuencias de señales, y una desviación única serina-treonina asociada con el potencial para la O-glicosilación y fosforilación, y tienen repeticiones en tándem y los dominios de ankirina en proteínas asociadas con interacciones huésped-patógeno (Collins et al., 2005; Hotopp et al., 2006; Frutos et al., 2006; Mavromatis et al., 2006) . Un pequeño subconjunto de más de 900 proteínas codificadas por cada uno de estos genomas es reconocido por anticuerpos (Doyle et al., 2006; McBride et al., 2003; McBride et al., 2000; Sumner et al., 2000) . Varias de las principales proteínas inmunorreactivas identificadas y caracterizadas molecularmente son glicoproteínas ricas en serina que son secretadas. Muchas de estas glicoproteínas tienen repeticiones en tándem; sin embargo, una tiene numerosos dominios de ankirina similares a los de eucariotes (Doyle et al., 2006; McBride et al., 2003; McBride et al., 2000; Nether y et al., 2005; Singu et al., 2005; Yu et al., 2000) .

Se han identificado numerosas proteínas en E. canis (n=12) y E. ruminantium (n=31) que contiene repeticiones en tándem. De manera notable, se han identificado tres proteínas inmunorreactivas con repeticiones en tándem y se han caracterizado molecularmente en E. chaffeensis (gp120, gp47, y VLPT) así como dos ortólogos en E. canis (gp140 y gp36, respectivamente) . El ortólogo del gen vlpt de E. chaffeensis no ha sido identificado en E. canis y se ha reportado que este gen no está presente en otros genomas erliquiales (Hotopp et al., 2006) . Una variabilidad extensa en el número y/o secuencia de repeticiones en tándem en las proteínas inmunorreactivas de E. chaffeensis (gp120, gp47 y VLPT) así como en el gp36 de E. canis está bien documentada (Chen et al., 1997; Doyle et al., 2006; Sumner et al., 1999) . La presencia de repeticiones en tándem tanto en regiones de codificación como de no codificación de genoma se ha relacionado con un proceso activo de expansión y reducción de los genomas en erliquiales (Frutos et al., 2006) y se considera una fuente principal de cambio e inestabilidad genómicos (Bzymek y Lovett 2001) . Adicionalmente, una proteína de 137 aminoácidos de EVLPT de E. canis ha sido definida como una proteína de membrana externa principal p19 (uni Prot Database, 2005) .

Aunque el VLPT de E. chaffeensis es inmunorreactivo, se sabe poco con respecto a su localización celular, función y papel en el desarrollo de inmunidad protectora. El gen vlpt de E. chaffeensis exhibe variaciones en el número de repeticiones en tándem de 90 bp (3 a5) y se ha utilizado como objetivo de diagnóstico molecular y para la diferenciación de aislados (Sumner et al., 1999; Yabsley et al., 2003) . El VLPT de E .chaffeensis Arkansas en una proteína de 198 aminoácidos que tiene cuatro repeticiones (30 aminoácidos) y tiene una masa molecular de aproximadamente el doble de la predicha por su secuencia de aminoácidos (Sumner et al., 1999) . La proteína VLPT de E. chaffeensis parece tener una modificación postranslacional consistente con otras glicoproteínas erliquiales descritas, pero la presencia de carbohidratos en VLPT no ha sido demostrado.

La presente invención satisface una necesidad en la técnica proveyendo novedosos métodos y composiciones concernientes a las infecciones erliquiales en mamíferos, y en particular provee métodos y composiciones en un ortólogo de E. canis de VLPT de E. chaffeensis.

Resumen de la invención La erliquiosis monocítica canina es una enfermedad producida por garrapatas distribuida globalmente causada por la bacteria intracelular obligada E. canis y es un modelo útil para entender los mecanismos inmunes y patogénicos de E. chaffeensis, el agente causante de la erliquiosis monocitotrópica en humanos. En general, la presente invención se relaciona con composiciones inmunogénicas erliquiales, incluyendo, por ejemplo, antígenos inmunoprotectores tales como vacunas para enfermedades erliquiales, tales como vacunas en subunidades, por ejemplo. La composición inmunológica puede ser empleada para cualquier mamífero, incluyendo, por ejemplo, humanos, perros, gatos, caballos, cerdos, cabras u ovejas.

En ciertos aspectos de la invención, hay identificación y caracterización de glicoproteína inmunorreactiva (gp19) principal de 19 kDa altamente conservada en E. canis, el ortólogo del VLPT de E. chaffeensis. La gp19 de E. canis carece de repeticiones en tándem presentes en el VLPT de E. chaffeensis, pero las dos proteínas exhiben una similitud en aminoácidos sustancial (59%) en una región terminal en carboxilo rica en cisteína/tirosina, y ambos genes tienen la misma localización cromosómica relativa. Se detectaron carbohidratos en el gp19 recombinante y se mapeo un epítopo de anticuerpo principal individual en un parche rico en serina/treonina/glutamato (STE) . Este epítopo fue sensible al tratamiento con per y odato, y una proteína recombinante de ejemplo fue sustancialmente más inmunorreactiva que un péptido sintético de ejemplo, demostrando un papel para los carbohidratos como inmunodeterminante, en ciertas realizaciones de la invención. El gp19 fue encontrado en ambas células reticuladas y de núcleo denso y también estuvo presente en la matriz extracelular y asociado con la membrana mórula, indicando que la proteína es secretada.

En aspectos específicos de la presente invención, hay composiciones de polipéptido gp19 erliquial (o composiciones de polinucleótidos que codifican todo o parte de ellas con una o más de las siguientes características: 1) comprende una o más unidades estructurales de carbohidrato, los cuales en realizaciones específicas comprenden parte de un determinante epítopo; 2) comprende una o más unidades estructurales, tales como un epítopo, que son inmunológicamente específicas de la especie; 3) se libera extracelularmente, por ejemplo mediante secreción; 4) comprende epítopos principales de células B; 5) se expone en la superficie; 6) está asociado con las formas infecciosas de núcleo denso de Ehrlichiae, tales como la superficie, por ejemplo; y 7) está asociada con membranas mórula (organismos Ehrlichiae de microcolonias dentro de las vacuolas celulares (mórulas) que alojan muchas Ehrlichiae individuales) que comprenden formas de núcleo denso. En aspectos adicionales, las composiciones de polipéptidos recombinantes de la presente invención son capaces de ser glicosiladas en una célula para la cual no son nativas, tales como una célula de E. coli, por ejemplo. El polipéptido recombinante puede ser empleado entonces como una composición inmunogénica, incluyendo, por ejemplo, una vacuna.

En realizaciones particulares de la invención, hay composiciones inmunogénicas de gp19 de E. canis que comprenden una secuencia de aminoácidos que es inmunogénica y en realizaciones particulares adicionales, la inmunogenicidad está caracterizada por ser al menos parte de un epítopo. En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoácidos comprende al menos parte de una composición de vacuna contra un organismo erliquial, tal como E. canis. La secuencia de aminoácidos puede comprender serinas, treoninas o, opcionalmente, alanina, prolina, valina y/o ácido glutámico. En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoácidos es glicosilada. En realizaciones adicionales específicas, la secuencia de aminoácidos comprende parte o todo de la siguiente secuencia de ejemplo: HFTGPTSFEVNLSEEEKMELQEVS (SEQ ID NO: 13) . Adicionalmente el epítopo puede comprender aminoácidos adicionales en el terminal C, tales como los que son inmediatamente terminales a C de la secuencia de SEQ ID NO: 13 en el gp19 de origen natural, tal como se ejemplifica por SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19. Puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos adicionales en el terminal... [Seguir leyendo]

1. Una composición, que comprende uno o más de los siguientes:

(a) un polipéptido aislado que consiste de SEQ ID NO: 13, o una parte inmunogénica del mismo; o

(b) un polipéptido aislado que es al menos 75% idéntico a SEQ ID NO: 13 y que tiene de 24 a 50 aminoácidos de longitud.

2. Una composición que comprende un polipéptido aislado que tiene al menos 75% de identidad con SEQ ID NO: 13 y que tiene de 24 a 50 aminoácidos de longitud, en donde dicho polipéptido es codificado por:

(a) un polinucleótido de SEQ ID NO: 20; o

(b) un polinucleótido que es capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas al polinucleótido de (a) .

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, definida adicionalmente como una composición farmacéutica, en donde dicho polipéptido está disperso en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

4. La composición de las reivindicaciones 1–3, en donde dicha composición se define adicionalmente como una composición de vacuna, o en donde el polipéptido está definido adicionalmente por comprender una o más unidades estructurales carbohidratos.

5. La composición de las reivindicaciones 1–3, en donde el polipéptido de (b) está definido adicionalmente por ser al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% idéntico a SEQ ID NO: 13.

6. Un polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 20; o un polinucleótido que es capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas a dicho polinucleótido y que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad con SEQ ID NO: 13 y que tiene de 24 a 50 aminoácidos de longitud, en donde dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a un promotor heterólogo.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 6, en donde se define adicionalmente como un polinucleótido que codifica un polipéptido que es al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% idéntico a SEQ ID NO: 13.

8. El polinucleótido aislado de la reivindicación 6, en donde el promotor heterólogo es un promotor eucariota o un promotor procariota, o en donde dicho polinucleótido está definido adicionalmente por estar comprendido en un vector, en particular en donde dicho vector es un vector viral o un vector no viral, más en particular en donde dicho vector viral comprende un vector adenoviral, un vector retroviral, o un vector viral adenoasociado, o en donde dicho polinucleótido está comprendido en un liposoma.

9. Un anticuerpo aislado que reacciona inmunológicamente con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 13 en donde dicho anticuerpo es monoclonal o es un fragmento de anticuerpo.

10. Un método para producir un polipéptido, que comprende:

proveer a una célula huésped que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 6-8; y

cultivar la célula bajo condiciones adecuadas para que la célula huésped exprese el polinucleótido para producir el polipéptido codificado, en particular que comprende adicionalmente aislar el polipéptido.

11. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en un método para inducir una respuesta inmune en un individuo, que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha composición.

12. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en un método para inhibir infección por E, canis en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto antes de la exposición o sospechoso de estar expuesto a o infectado con E. canis, una cantidad efectiva de dicha composición.

13. Un método para identificar una infección por E, canis en un individuo, que comprende la etapa de probar una muestra del individuo para uno o ambos de los siguientes:

(a) un polipéptido de SEQ ID NO: 13; o

(b) un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

14. El método de la reivindicación 13, en donde (b) está definido adicionalmente como el ensayo para un anticuerpo por ELISA, en particular en donde ELISA permite probar uno o más anticuerpos de E. canis diferentes al anticuerpo de (b) , más en particular en donde los otros anticuerpos de E. canis se seleccionan del grupo consistentes de anticuerpos para gp36, gp19, gp28/30 y gp200.

15. Un kit, que comprende una o más de las siguientes composiciones:

(a) un polipéptido aislado consistente de SEQ ID NO: 13;

(b) un polipéptido aislado que es al menos 75% idéntico a SEQ ID NO: 13 y que tiene de 24 a 50 aminoácidos de longitud; o

(c) un anticuerpo aislado que reacciona inmunológicamente con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde dicho anticuerpo es monoclonal o es un fragmento de anticuerpo.