Genes y procedimientos para aumentar la resistencia a enfermedades en plantas.

Una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº:

1 y (ii) un promotorque funciona en plantas, en las que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente al promotor de modo queeste último expresa una secuencia polipeptídica expuesta en la SEC ID Nº: 14.

Genes y procedimientos para aumentar la resistencia a enfermedades en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y de la regulación del sistema de defensa natural de las plantas mediante la introducción de genes extraños/naturales en las células vegetales, preferiblemente en sus genomas. De forma más específica, el procedimiento se refiere a aumentar la resistencia a enfermedades de los cítricos mediante la sobreexpresión de los genes implicados en el sistema de defensa innato de las plantas.

Introducción En la naturaleza, plantas y animales están en permanente contacto con un conjunto muy diverso de microorganismos, aunque raras veces esta asociación da como resultado enfermedades. Esto es debido principalmente a la existencia de sistemas de defensa que, en el caso de las plantas, carecen de la respuesta inmune adaptativa común en el reino animal.

La capacidad de una planta de reconocer un patógeno y de activar una defensa eficaz está controlada a menudo por la interacción (directa o indirecta) entre los productos de un gen de resistencia de la planta y un gen de avirulencia del patógeno. Dangl y Jones, 2001, Nature 411, 826-33. Como consecuencia de esta interacción gen a gen, el tejido recientemente infectado puede presentar flujos de iones, la producción de especies reactivas de oxígeno, ácido salicílico (SA) , óxido nítrico, y un aumento en la expresión de los genes asociados a la defensa, incluyendo aquellos que codifican las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) . Durrant y Dong, 2004, Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42: 185-209. Además, las células que rodean el (los) sitio (s) de entrada del patógeno experimentan normalmente la muerte celular de tipo apoptótico, formando por tanto las características lesiones necróticas de la respuesta hipersensible (HR) . Heath, 2000, Plant Molecular Biology 44: 321-34.

Hasta la flecha, se han clonado algunos genes de resistencia de plantas (genes R) y, basándose en la estructura de las proteínas que codifican, los genes se han dividido en diversos grupos (Hammond-Kosack y Jones, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48, 575-607) . La mayoría de los genes R codifican proteínas NB-LRR citoplásmicas, que contienen un sitio de unión a nucleótido (NB) y repeticiones ricas en leucina (LRR) . Este grupo consiste en genes que codifican proteínas CC-NB-LRR, que contiene un dominio de superhélice y genes que codifican proteínas que tienen un dominio similar a los receptores Toll y de la interleucina (IL) de mamíferos, las denominadas proteínas TIR-NB-LRR (Hammond-Kosack y Jones, 1997, más arriba) .

El uso de dichos genes de resistencia específica en programas de reproducción para una resistencia duradera es problemático debido a que los patógenos evitan fácilmente el reconocimiento mediante mutaciones en sus factores de avirulencia, evitando de este modo la inducción de la defensa activa (Westerink y col., 2004, Mol. Microbiol. 54, 533-545) . La similitud entre las proteínas de resistencia (proteínas R) sugiere la existencia de rutas de resistencia comunes (Shirasu y Schulze-Lefert, 2000, Plant Mol. Biol. 44, 371-385) . Por tanto, la identificación de los genes adicionales requeridos para la resistencia no proporciona solo información sobre cómo funcionan dichas rutas de señalización sino que puede permitir también utilizarla para identificar los genes que juegan un papel más general en la resistencia.

A pesar de la creciente información acerca de las rutas de resistencia a enfermedades, sigue existiendo necesidad de identificar los genes y las proteínas que se pueden utilizar para crear plantas con un amplio rango duradero de resistencia a enfermedades. Es un objetivo de la invención proporcionar dichos ácidos nucleicos, proteínas y procedimientos para crear plantas, especialmente plantas que pertenecen a la familia Rutaceae, con resistencia a enfermedades aumentada.

Resumen de la invención En un aspecto, la invención proporciona una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 y (ii) un promotor que funciona en plantas, en la que la secuencia de nucleótidos está unida de forma operable al promotor de tal manera que el último expresa la secuencia polipeptídica que se muestra en la SEC ID Nº: 14. En una realización, el promotor se selecciona entre un promotor CA/IV de 35S, el promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido, y un promotor preferido de tejido. En otro aspecto, la invención proporciona una célula vegetal que comprende la construcción.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende sobreexpresar la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende (a) transformar una planta o célula con una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1, unida de manera operable con un promotor activo en células vegetales, (b) regenerar una planta a partir de dicha planta o célula transformada y (c) seleccionar una planta o célula que tiene una resistencia aumentada a la enfermedad del chancro de los cítricos con respecto a una planta control. En una realización, el promotor se une de manera operable a un potenciador. En otra realización, el promotor es un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido. En una realización adicional, el promotor específico de tejido es un promotor específico de xilema, un promotor específico de floema, o un promotor específico de xilema/floema. En otra realización, la planta es un miembro de la familia Rutaceae. En una realización adicional, la planta se selecciona entre los géneros Citrus, Poncirus, Fortunella, Murraya, Microcitrus, Limonia, y Eremocitrus.

En otro aspecto, la invención proporciona una planta transgénica que tiene incorporado en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de resistencia a enfermedades que se muestra en la SEC ID Nº: 14. En una realización, el polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1. En una realización adicional, la progenie, el fruto, o la semilla de la planta comprende dicha secuencia de nucleótidos. Materia que ya no constituye aspectos de la invención se mantiene en los siguientes párrafos de la memoria descriptiva como técnica antecedente de utilidad para la comprensión de la invención.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Perfiles de expresión en silicio de una muestra seleccionada de genes identificados en bibliotecas de ADNc construidas a partir de tejido de hoja de cítrico previamente estimulada con Xanthomonas axonopodis pv citri (A-12h, A-24h e A-48h) y Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (C-12h, C-24h y C-48h) .

Figura 2. Expresión diferencial de genes deg seleccionados en cítricos estimulados con Xanthomonas axonopodis pv citri (A-12, A-24 e A-48) y Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (C-12h, C-24h y C-48h) .

Figura 3. Representación esquemática de los vectores pr35S (2x) -CaMV::ahas::35SpolyA pr35SCaMV::deg::NOSpolyA.

Figura 4. Diagrama a escala que ilustra el desarrollo de lesiones de chancro de los cítricos en hojas de naranja dulce artificialmente inoculadas con una suspensión bacteriana de Xanthomonas axonopodis pv citri.

Figura 5. Gravedad de la enfermedad en eventos seleccionados pr35S-CaMV::deg::NOSpolyA y variedad de control en Pineapple (C) .

Figura 6. Tasa de crecimiento diferencial de la bacteria del chancro de los cítricos en cítricos que contienen las construcciones pr35S-CaMV::deg:: NOSpolyA y la variedad de control Pineapple (C) .

Figura 7. Niveles de expresión del transgén en eventos seleccionados que contienen las construcciones pr35SCaMV::deg::NOSpolyA y la variedad de control Pineapple (C) .

Breve descripción del listado de secuencias SEC ID Nº: 1 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una proteína rica en glicina que pertenece a la familia de la seferina de péptidos antimicrobianos.

SEC ID Nº: 2 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima de la familia de las peroxidasas.

SEC ID Nº: 3 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con un péptido antimicrobiano de la familia de la esnaquina.

SEC ID Nº: 4 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud... [Seguir leyendo]

1. Una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 y (ii) un promotor que funciona en plantas, en las que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente al promotor de modo que este último expresa una secuencia polipeptídica expuesta en la SEC ID Nº: 14.

2. La construcción de la reivindicación 1, en la que el promotor se selecciona de un promotor 35S del CaMv, un promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido y un promotor preferido de tejido.

3. Una célula vegetal que comprende la construcción de la reivindicación 1.

4. Un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende sobreexpresar la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 1.

5. Un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende

(a) transformar una planta o célula con una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1, unida operativamente a un promotor activo en células vegetales.

(b) regenerar una planta a partir de dicha célula o planta transformada;

(c) seleccionar una planta o célula que tiene una resistencia incrementada a la enfermedad del chancro de los cítricos respecto a una planta control.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el promotor es un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el promotor específico de tejido es un promotor específico del xilema, un promotor específico del floema o un promotor específico del xilema/floema.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el promotor está unido operativamente a un potenciador.

9. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la planta es un miembro de la familia Rutaceae.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha planta se selecciona de los géneros Citrus, Poncirus, Fortunella, Murraya, Microcitrus, Limonia y Eremocitrus.

11. Una planta transgénica o una progenie, fruto o semilla de la misma, teniendo dicha planta, progenie, fruto o semilla incorporada en su genoma

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de resistencia a la enfermedad expuesto en la SEC ID Nº: 14, y

(ii) un promotor que funciona en plantas y que está operativamente unido a la secuencia de nucleótidos, en el que dicha planta sobreexpresa el polipéptido de resistencia a la enfermedad.

12. La planta transgénica de la reivindicación 11, en la que la secuencia de nucleótidos es la expuesta en la SEC ID Nº 1.

13. La planta transgénica de la reivindicación 11, que tiene además incorporada en su genoma (iii) una secuencia potenciadora que se condensa con el promotor.

14. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el promotor se selecciona de un promotor 35S del CaMv, un promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido y un promotor preferido de tejido.