Generación de plantas con contenido alterado de aceite.

Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia denucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID.

SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite enrelación con plantas testigo.

Generación de plantas con contenido alterado de aceite.

Antecedentes de la invención La capacidad para manipular la composición de semillas para cultivo, particularmente el contenido y la composición de los aceites de semillas, presenta importantes aplicaciones en las industrias agrícolas, tanto en cuanto a los aceites alimenticios procesados como en cuanto a los aceites para alimentación de animales. Las semillas de cultivos agrícolas contienen una diversidad de componentes valiosos, incluyendo aceite, proteína y almidón. El procesamiento industrial permite separar algunos de estos componentes, o todos, para la venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, casi el 60% de la cosecha de soja de EE.UU. es machacada por la industria de procesamiento de soja. El procesamiento de la soja produce aceite purificado, que es vendido a precio elevado, mientras que el resto es vendido principalmente para pienso para ganado a menor precio (US Soybean Board, 2001 Soy Stats) . La semilla de canola es machacada para producir aceite y la harina de canola como coproducto (Canola Council of Canada) . Casi el 20% de la cosecha 1999/2000 de maíz de EE.UU. fue industrialmente refinada, principalmente para la producción de almidón, etanol y aceite (Corn Refiners Association) . Por lo tanto, a menudo es deseable maximizar el contenido de aceite de las semillas. Por ejemplo, para semillas oleaginosas procesadas tales como las de soja y canola, un aumento del contenido absoluto de aceite de la semilla aumentará el precio de dichos granos. Para el maíz procesado, se puede desear aumentar o disminuir el contenido de aceite dependiendo de la utilización de otros componentes principales. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado al reducirse los indeseados sabores asociados con la oxidación del aceite. Alternativamente, en la producción de etanol, donde el sabor no importa, el aumento del contenido de aceite puede aumentar el valor global. En muchos granos para pienso, tales como los de maíz y trigo, es deseable aumentar el contenido de aceite de las semillas porque el aceite tiene mayor contenido energético que otros componentes de las semillas, tales como los hidratos de carbono. El procesamiento de semillas oleaginosas, como la mayoría de los negocios de procesamiento de granos, es un negocio que requiere grandes inversiones y recursos; por ello, pequeños cambios en la distribución de los productos, de componentes de bajo valor a componente oleoso de alto valor, pueden producir sustanciales impactos económicos en las empresas procesadoras de granos.

La manipulación biotecnológica de aceites puede proporcionar una alteración de la composición y una mejora de la producción de aceite. Las alteraciones de la composición incluyen, entre otras, aceites de soja y maíz con alto contenido oleico (Patentes de EE.UU. números 6.229.033 y 6.248.939) y semillas que contienen laurato (Patente de EE.UU. nº 5.639.790) . El trabajo en la alteración de la composición se ha centrado predominantemente en las semillas oleaginosas procesadas pero se ha extendido rápidamente a cultivos de semillas no oleaginosas, incluyendo el maíz. Aunque hay un considerable interés en aumentar el contenido de aceite, la única biotecnología actualmente puesta en práctica en este área es la tecnología High-Oil Corn (HOC) (DuPont, Patente de EE.UU. nº 5.704.160) . En la HOC se emplean polinizadores de alto contenido de aceite desarrollados mediante cría selectiva clásica junto con hembras híbridas (de parte masculina estéril) selectas en un sistema de producción al que se hace referencia como TopCross. El sistema TopCross High Oil eleva el contenido de aceite de los granos recolectados de maíz de ~3, 5% a ~7%, mejorando el contenido energético del grano.

Aunque ha sido fructífero, el sistema de producción HOC presenta limitaciones inherentes. En primer lugar, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables del conjunto de semillas de un campo completo contiene riesgos inherentes, particularmente en años de sequía. En segundo lugar, los contenidos de aceite de los actuales campos de HOC han alcanzado una meseta de aproximadamente 9% de aceite. Finalmente, el maíz con alto contenido de aceite no es esencialmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (tamaño de embrión aumentado) que presenta el resultado indirecto de un aumento del contenido de aceite. Por estas razones, sería especialmente valiosa una estrategia alternativa para alto contenido de aceite, particularmente una que derivara de una producción bioquímica alterada.

Los cultivos diana más obvios para el mercado del aceite procesado son la soja y la semilla de colza, y una gran recopilación de trabajo comercial (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.952.544 y la solicitud PCT WO9411516) demuestra que Arabidopsis es un excelente modelo para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Exploraciones bioquímicas en la composición del aceite de semillas han permitido identificar genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas y han conducido a la identificación de genes ortólogos agronómicamente importantes. Por ejemplo, exploraciones en que se usan poblaciones sometidas a mutagénesis química han permitido identificar mutantes lipídicos cuyas semillas presentan una composición de ácidos grasos alterada (B. Lemieux et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 234-240; D. W. James y H. K. Dooner, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 241-245) . Exploraciones de mutagénesis por DNA de transferencia (DNA-T) (Feldmann et al., Science 243, 1351-1354, 1989) que permitían detectar una composición de ácidos grasos alterada permitieron identificar los genes de omega-3 desaturasa (FAD3) y delta-12 desaturasa (FAD2) (Patente de EE.UU. nº 5952544; N. S. Yadav et al., 1993, Plant Physiol. 103, 467-476; Okuley et al., Plant Cell, enero de 1994, 6 (1) : 147-58) . En una exploración que se centraba en el contenido de aceite en vez de en la calidad del aceite, se analizaban mutantes químicamente inducidos en cuanto a semillas arrugadas o densidad de semillas alterada, a partir de lo cual se infería un contenido alterado de aceite de semillas (N. Focks y C. Benning, Plant Physiol. 118: 91-101, 1998) . Otra exploración, diseñada para identificar enzimas implicadas en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga, permitió identificar una mutación en el gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) como responsable de una acumulación reducida de triacilglicerol en semillas (V. Katavic et al., Plant Physiol., mayo de 1995, 108 (1) : 399-409) . Se mostró además que la sobreexpresión, específica de semillas, del cDNA de DGAT estaba asociada con un contenido aumentado de aceite de semillas (Jako et al., Plant Physiol., junio de 2001, 126 (2) : 861-74) .

En las plantas, el etiquetado por activación se refiere a un método para generar mutaciones aleatorias mediante la inserción de una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende secuencias reguladoras (por ejemplo, un potenciador) en el genoma de una planta. Las secuencias reguladoras pueden actuar para potenciar la transcripción de uno o más genes nativos de la planta; en consecuencia, el etiquetado por activación es un método fructífero para generar "ganancia de función", generalmente mutantes dominantes [véanse, por ejemplo, Hayashi et al., Science (1992) 258: 1350-1353; y Weigel et al., Plant Physiology (2000) 122: 1003-1013]. La construcción insertada proporciona una etiqueta molecular para la rápida identificación de la planta nativa cuya expresión incorrecta causa el fenotipo mutante. El etiquetado por activación puede también causar fenotipos con "pérdida de función". La inserción puede dar lugar a la alteración de un gen nativo de la planta, en cuyo caso el fenotipo es generalmente recesivo.

El etiquetado por activación ha sido usado en diversas especies, incluyendo el tabaco y Arabidopsis, para identificar muchas clases diferentes de fenotipos mutantes y los genes asociados con estos fenotipos [Wilson et al., Plant Cell (1996) 8: 659-671; Schaffer et al., Cell (1998) 93: 1219-1229; Fridborg et al, Plant Cell (1999) 11: 1019-1032; Kardailsky et al., Science (1999) 286: 1962-1965; S. Christensen et al., 9th International Conference on Arabidopsis Research, Univ. of Wisconsin-Madison, 24-28 de junio de 1998, Resumen 165].

Compendio de la invención La invención proporciona una planta transgénica como la expuesta en la Reivindicación 1 adjunta. En realizaciones preferidas, la planta transgénica es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete. La invención proporciona además un método para... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

2. Una planta transgénica que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

3. La planta transgénica de la Reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

4. La planta transgénica de la Reivindicación 3, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

5. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 2.

6. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, que es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

7. Un tejido u órgano transgénico de la planta de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5.

8. Un tejido u órgano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 7, que es una semilla.

9. Un método para producir aceite, que comprende cultivar la planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5 y recuperar aceite de dicha planta.

10. Un método para producir una planta que tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite, método que comprende:

a) introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, y

b) cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia polinucleotídica se expresa y dicha planta transgénica presenta un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

11. El método de la Reivindicación 10, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

12. El método de la Reivindicación 10 u 11, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

13. El método de cualquiera de las 1. a 12, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 2.

14. El método de cualquiera de las 1. a 13, en donde dicha planta es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

15. Un método para generar una planta que tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite, en el que se emplea la metodología TILLING, que comprende:

inducir mutaciones en la semilla de la planta;

cultivar plantas a partir de la semilla mutada; e identificar una planta que tiene una mutación en la secuencia génica ID. SEC. nº 1 que da lugar a un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en comparación con las plantas que carecen de la mutación.

16. El método de la Reivindicación 15, en donde las mutaciones se inducen mediante tratamiento con EMS.

17. El método de la Reivindicación 15, en donde la identificación de la planta que tiene una mutación en la secuencia génica ID. SEC. nº 1 comprende:

autofertilizar las plantas cultivadas a partir de la semilla mutada, para obtener una progenie; aislar DNA de las plantas de la progenie; utilizar una PCR para identificar mutantes en la secuencia ID. SEC. nº 1; y examinar el contenido de aceite de las plantas que tienen mutaciones en la secuencia ID. SEC. nº 1.