Expresión de genes aumentada por intensificadores, en plantas.

Un método para proporcionar un aumento de la expresión de uno o más genes en uno o más órganos de unaplanta intensificando la actividad de un promotor de uno o más genes utilizando una secuencia intensificadoraaislada y/o purificada,

consistiendo el intensificador en una secuencia aislada seleccionada del grupo que consisteen el SEQ ID NO: 1 de la Figura 6; una secuencia que es una subsecuencia encontrada en el SEQ ID NO: 1, cuyasubsecuencia es rica en bases A y T, comprendiendo la cantidad total de bases A y T más de 50% de la secuenciade nucleótidos, y activa como intensificador; el SEQ ID NO: 2 de la Figura 7; las siguientes secuencias del SEQ IDNO: 1: secuencias de pares de bases de los nucleótidos -444 a -389, -388 a -284, -283 a -179, -444 a -284 y -388 a-179; y el SEQ ID NO: 3 de la Figura 8; en donde dicho método comprende

(i) obtener la secuencia intensificadora de un gen de una planta o producir sintéticamente la secuenciaintensificadora; y

(ii) formar un gen quimérico que comprende la secuencia intensificadora aislada y/o purificada, el promotor,una secuencia codificante o no codificante y una secuencia terminadora;incrementándose la actividad incrementada del promotor en comparación con la actividad del promotor sin que dichasecuencia intensificadora esté presente.

Expresión de genes aumentada por intensificadores, en plantas Esta invención se refiere al aumento de la expresión de un gen, y, en particular, a la alteración de la actividad del promotor del gen.

La manipulación genética depende de la introducción de genes quiméricos en plantas y la expresión del gen introducido depende del promotor. Hay muchas razones por las que sería ventajoso tener un método para mejorar la eficacia del promotor de estos genes. Los diferentes promotores funcionan con diferentes eficiencias en diferentes tejidos. Los diferentes promotores funcionan con diferentes eficiencias en el mismo tejido, algunos, tales como el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (35S CaMV) , son considerados comúnmente como un promotor más fuerte que el promotor del gen nos. Los promotores comúnmente consisten en más de 1.000 bp y cuando se acortan funcionan con menos eficacia. Sin embargo, las secciones largas de ADN producen dificultades técnicas en los mecanismos de ADN recombinante. Por lo tanto, hay muchos casos en los que puede requerirse una expresión mejorada. En experimentos que implican antisentido, podría ser necesaria la expresión más alta posible para lograr un resultado comercial. Es, por lo tanto, una ventaja tener constructos de ADN disponibles que mejoren, en las condiciones apropiadas, la expresión de un gen dado.

Las secuencias que activan la transcripción se han denominado intensificadores (Simpson et al. Nature (1986) 323, 551-554) y se ha obtenido una secuencia que es activa como intensificador a partir del promotor 35S de CaMV (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.164.316) . El promotor 35S que contiene esta región intensificadora está activo en muchas plantas y el promotor ha sido descrito como constitutivo, actuando en muchos tejidos. Sin embargo, si bien se han sugerido regiones intensificadoras para los genes de plantas, no se había reconocido previamente que parte de un promotor de una planta pudiera tener una actividad intensificadora en varios órganos diferentes y en especies diferentes. Por ejemplo, la región -352 a -2 del gen RbcS del guisante se unió al promotor nos bacteriano y esto produjo una fuerte expresión inducida por la luz en los tejidos fotosintéticos. Experimentos similares en los que se colocaba el elemento aguas abajo de la secuencia codificante no causaron expresión en el tabaco (Fluhr et al, Science (1986) 232, 1106-1111) .

El gen PetE de guisante fue aislado por Last, D.I. y Gray, J.C. (Plant Molecular Biology (1989) 12, 655-666) . Este gen codifica la plastocianina que es una proteína de cobre de 10 kDa implicada en la transferencia fotosintética de electrones. Por lo tanto, se requiere la expresión de este gen en órganos, tales como hojas y tallos en las células que contienen cloroplastos. Estudios de deleción con la región promotora de este gen sugirieron que el promotor era activo en las hojas, tallos y flores, pero no en las raíces, y que un elemento aguas arriba de -784 a -992 reprimía la expresión en las hojas (véase, por ejemplo, Pwee, K-H. et al., The Plant Journal (1993) 3 (3) 437-449 y Dupree, P. et al., The Plant Journal (1991) 1 115-120) . La eliminación de esta región produjo un promotor muy "fuerte" (Pwee, KH. y Gray, J.C. The Plant Journal (1993) 3 437-449) .

También se han llevado a cabo estudios de deleción en el gen PetE de Arabidopsis (Vorst, O. et al., The Plant Journal (1993) 4 (6) 933-945) , revelando la presencia de un elemento regulador positivo fuerte en la región aguas arriba del promotor PetE de Arabidopsis. La deleción de esta parte del promotor dio como resultado una marcada reducción de la actividad del promotor y una pérdida de la dependencia del cloroplasto de la expresión del gen informador. También se han descrito dos supuestos sitios de unión a proteínas en este elemento regulador positivo bastante aguas arriba, que pueden tener implicaciones reguladoras en la expresión del promotor PetE de Arabidopsis (Fisscher, U. et al., Plant Molecular Biology (1994) 26 873-886) .

La invención se basa en el sorprendente hallazgo de que un gen expresado en el tejido fotosintético verde de guisante tiene una región intensificadora que es activa en otras especies y en otros tejidos, incluidos los tejidos no fotosintéticos.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a una secuencia de ADN que es activa como un intensificador y provoca un aumento en la expresión de un promotor expresado en los tejidos verdes.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ADN que es activa como un intensificador y provoca un aumento en la expresión de cualquier promotor que se expresa en uno o más de las raíces, tubérculos, tallos, hojas, flores o semillas de las plantas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de intensificación de la expresión de genes en plantas distintas de la planta de la que se obtuvo la secuencia.

La presente invención proporciona un método para facilitar un aumento de la expresión de uno o más genes en uno o más órganos de una planta intensificando la actividad de un promotor de los uno o más genes utilizando una secuencia intensificadora aislada y/o purificada, consistiendo el intensificador en una secuencia aislada seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 de la Figura 6; una secuencia que es una subsecuencia encontrada en el SEQ ID NO: 1, cuya subsecuencia es rica en bases A y T, comprendiendo la cantidad total de bases A y T más de 50% de la secuencia de nucleótidos, y activa como intensificador; el SEQ ID NO: 2 de la Figura 7; las siguientes secuencias del SEQ ID NO: 1: las secuencias de pares de bases de los nucleótidos -44 a -389, -388 a -284, -283 a 179, -444 a -284 y -388 a -179; y el SEQ ID NO: 3 de la Figura 8; en donde dicho método comprende (i) obtener la secuencia intensificadora de un gen de una planta o producir sintéticamente la secuencia intensificadora; y (ii) formar un gen quimérico que comprende la secuencia intensificadora aislada y/o purificada, el promotor, una secuencia codificante o no codificante y una secuencia terminadora; incrementándose la actividad incrementada del promotor en comparación con la actividad del promotor sin que dicha secuencia intensificadora esté presente.

Según se utiliza en la presente memoria un aumento de la expresión significa que la expresión del gen cuando se utiliza con el intensificador como el descrito en la presente invención es mayor que la que se observaría sin utilizar el intensificador de la expresión de ese gen.

Ventajosamente, el intensificador se obtiene a partir de un gen vegetal o se produce sintéticamente. El intensificador puede ser un homólogo del gen vegetal o de la secuencia producida sintéticamente.

Ventajosamente, el intensificador se obtiene a partir de un gen expresado en el guisante. Más ventajosamente, el gen se expresa en los tejidos fotosintéticos verdes del guisante, en particular, en las hojas de la planta de guisante.

Preferiblemente, el aumento de la expresión del gen que se va a incorporar a uno o más órganos de la planta es una planta que es diferente de la planta de la cual se obtuvo el intensificador. La diferencia puede ser una diferencia en el tipo de planta, es decir, la familia, u otra planta de la misma familia de plantas.

La presente invención hace referencia a un intensificador, siendo el intensificador una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 de la Figura 6; una secuencia que es una subsecuencia encontrada en el SEQ ID NO: 1, cuya subsecuencia es rica en bases A y T, comprendiendo la cantidad total de bases A y T más de 50% de la secuencia de nucleótidos, y activa como intensificador; el SEQ ID NO: 2 de la Figura 7; las siguientes secuencias del SEQ ID NO: 1: secuencias de pares de bases de los nucleótidos -444 a -389, -388 a -284, -283 a 179, -444 a -284 y -388 a -179; y el SEQ ID NO: 3 de la Figura 8.

La secuencia intensificadora puede ser adecuadamente una secuencia aislada y/o purificada.

Preferiblemente, la subsecuencia comprende al menos 35% de bases A y al menos 35% de bases T. Una de las bases A o T, puede incluso estar presente en 40, 45% o 50%, o más, de la subsecuencia. La subsecuencia puede comprender sólo bases A y T.

El SEQ ID NO: 2 es una región de 31 pb del SEQ ID NO: 1.

Una secuencia similar también puede ser conocida como un homólogo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término homólogo representa un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica, o similar, a otra secuencia de nucleótidos. La similitud debe ser suficiente para permitir que la secuencia de nucleótidos actúe como un intensificador de acuerdo con la invención.

Preferiblemente,... [Seguir leyendo]

1. Un método para proporcionar un aumento de la expresión de uno o más genes en uno o más órganos de una planta intensificando la actividad de un promotor de uno o más genes utilizando una secuencia intensificadora aislada y/o purificada, consistiendo el intensificador en una secuencia aislada seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 de la Figura 6; una secuencia que es una subsecuencia encontrada en el SEQ ID NO: 1, cuya subsecuencia es rica en bases A y T, comprendiendo la cantidad total de bases A y T más de 50% de la secuencia de nucleótidos, y activa como intensificador; el SEQ ID NO: 2 de la Figura 7; las siguientes secuencias del SEQ ID NO: 1: secuencias de pares de bases de los nucleótidos -444 a -389, -388 a -284, -283 a -179, -444 a -284 y -388 a -179; y el SEQ ID NO: 3 de la Figura 8; en donde dicho método comprende

(i) obtener la secuencia intensificadora de un gen de una planta o producir sintéticamente la secuencia intensificadora; y

(ii) formar un gen quimérico que comprende la secuencia intensificadora aislada y/o purificada, el promotor, una secuencia codificante o no codificante y una secuencia terminadora;

incrementándose la actividad incrementada del promotor en comparación con la actividad del promotor sin que dicha secuencia intensificadora esté presente.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la subsecuencia comprende al menos 35% de bases A y T, respectivamente.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde una de las bases A o T está presente al menos en 40%, 45% o 50% del intensificador.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha subsecuencia comprende solamente bases A y T.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el promotor es un promotor de una planta.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el intensificador ocasiona un incremento de la expresión del gen en tejidos verdes o no verdes de plantas.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el incremento de la expresión se produce en las raíces, tubérculos, semillas, tallos, flores u hojas de tales plantas.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el intensificador funciona tanto en orientación normal como inversa.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el intensificador está unido al promotor o al terminador del gen que se va a expresar.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el método comprende transformar una planta.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la planta transformada es una especie dicotiledónea o una especie monocotiledónea.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha planta es patata, tabaco, algodón, lechuga, melón, calabaza, pepino, guisante, colza, soja, remolacha azucarera, girasol, trigo, cebada, centeno, arroz o maíz.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el gen quimérico comprende más de uno de dicho intensificador y más de un promotor.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho intensificador está conectado operablemente a dicho promotor, y dicho intensificador está en orientación normal o inversa.

15. Un gen quimérico que comprende un intensificador, consistiendo el intensificador en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 de la Figura 6; una secuencia que es una subsecuencia encontrada en el SEQ ID NO: 1, cuya subsecuencia es rica en bases A y T, comprendiendo la cantidad total de bases A y T más de 50% de la secuencia de nucleótidos, y activa como intensificador; el SEQ ID NO: 2 de la Figura 7; las siguientes secuencias del SEQ ID NO: 1: las secuencias de pares de bases de los nucleótidos -444 a -389, -388 a -284, 283 a -179, -444 a -284 y -388 a -179; y el SEQ ID NO: 3 de la Figura 8, un promotor del gen, una secuencia codificante o no codificante y una secuencia terminadora, en donde la secuencia intensificadora se obtiene de un gen de una planta, o se produce sintéticamente, en una forma aislada y/o purificada, y conectada operablemente a dicho promotor para formar un gen quimérico.

16. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende más de uno de dicho intensificador y más

de un promotor.

17. Un gen quimérico de acuerdo con a reivindicación 15 o 16, en donde dicho intensificador está en una orientación normal o inversa.

18. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en el intensificador del SEQ ID NO: 1 en una orientación normal o inversa, un promotor de un gen, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos, en donde dicho promotor se selecciona entre el promotor PetE -175/+4 mínimo, el promotor de la patatina -330/+1 mínimo y el promotor de la metalotioneína de guisante -806/-1 PsMTA.

19. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en el intensificador del SEQ ID NO: 1 en orientación normal o inversa, el promotor de CaMV de 35S (-90) mínimo, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos.

20. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en un intensificador en orientación normal, el promotor PetE -175/+4 mínimo, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos, en donde el intensificador se selecciona del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 2, las siguientes secuencias del SEQ ID NO: 1: las secuencias de pares de bases de los nucleótidos -444 a -389, -388 a -284, -283 a -179, -444 a -284 y -388 a -179 y el SEQ ID NO: 3.

21. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en tres copias adyacentes del intensificador del SEQ ID NO: 2 en una orientación normal, el promotor PetE -175/+4 mínimo, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos, en donde dichas tres copias adyacentes de dicho intensificador está conectadas operablemente a dicho promotor.

22. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en dos a cuatro copias adyacentes del intensificador del SEQ ID NO: 3 en una orientación normal, el promotor PetE -175/+4 mínimo, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos, en donde dichas dos o cuatro copias adyacentes de dicho intensificador está conectadas operablemente a dicho promotor.

23. Un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en una, dos o cuatro copias adyacentes del intensificador del SEQ ID NO: 3 en una orientación normal, el promotor PsMTA de la metalotioneína de guisante 806/-1, una secuencia capaz de conferir un carácter identificable a una planta transformada y el terminador nos, en donde dichas una, dos o cuatro copias adyacentes de dicho intensificador está conectadas operablemente a dicho promotor.

24. Una planta transformada que tiene el gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

25. Una planta de tabaco transformada que tiene el gen quimérico de la reivindicación 18, en donde el promotor es el promotor PetE -175/+4 mínimo o el promotor PsMTA de la metalotioneína de guisante -806/-1.

26. Una planta de patata transformada que tiene el gen quimérico de la reivindicación 18, en donde el promotor es el promotor de patatina -330/+1 mínimo.

27. Una planta de tabaco transformada que tiene el quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 19-23.

28. Propágulos de una plata transformada con un gen quimérico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, teniendo dichos propágulos dicho gen quimérico.

29. Una célula que tiene el gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17.