Exportación y modificación de poli(péptidos) de tipo lantibiótico.

Un método para producir, en una célula hospedadora, un polipéptido que contiene un puente tioéter,

cuyo origenno es una bacteria Gram-positiva, comprendiendo el procedimiento;

a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y unsegundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, en la que

- el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmenteequivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico, y en el que estepéptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal maneraque pueda producirse la formación de un puente tioéter;

- el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia amodificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias constituido por Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es un cualquier aminoácido y donde n es 1-13, y donde el polipéptidono tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

b) seleccionar la célula hospedadora para detectar la presencia de la proteína transportadora LanT;

c) traducir la molécula de ácido nucleico, produciendo de este modo un péptido de fusión del péptido líder delantibiótico y el polipéptido que comprende la secuencia seleccionada del grupo de secuencias constituido porSer-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y

d) recoger el polipéptido que contiene el puente tioéter de un medio de la célula hospedadora.

Exportación y modificación de poli (péptidos) de tipo lantibiótico La invención se refiere al campo de los lantibióticos y al campo de las modificaciones post-traduccionales de (poli) péptidos.

Los lantibióticos forman un grupo de péptidos antibióticos únicos modificados post-traduccionalmente y sintetizados ribosomalmente producidos por, y que actúan principalmente sobre, bacterias Gram-positivas (para una revisión véase McAuliffe et al., FEMS Microbiol. Rev. 25: 285-308 (2001) . Dado que, por definición, contienen puentes tioéter intramoleculares o anillos formados por los aminoácidos con grupos tioéter, lantionina (Lan) y 3-metil lantionina (MeLan) y dado que todos son antibióticos peptídicos con actividad bactericida de moderada a fuerte, estos toman su nombre de estas propiedades más llamativas.

Los anillos tioéter protegen a los péptidos contra la degradación proteolítica. Por ejemplo, el lantibiótico nisina permanece activo después de tratamiento con tripsina. Los anillos tioéter son esenciales para algunas actividades de los lantibióticos. Por ejemplo, la apertura del anillo A o C en la nisina suprime la capacidad de permeabilización de la membrana. El anillo A de la nisina es necesario con respecto a su capacidad para autoinducir su propia síntesis y con respecto a la capacidad de la nisina para bloquear la síntesis del peptidoglucano interaccionando con el lípido II. Es esencial tener anillos tioéter y no puentes disulfuro dado que el reemplazo de anillos tioéter por puentes disulfuro conduce a la pérdida de actividad microbiana.

No deterioran el ambiente y no son tóxicos para los animales o el hombre y encuentran, o pueden encontrar, aplicaciones como bioconservantes en la preparación de alimentos y bebidas, pero también como agente bactericida 25 en productos cosméticos, veterinarios y médicos. Dado que el creciente número de microorganismos patógenos resistentes a fármacos múltiples ha creado la amenaza de otra “era preantibiótica” para muchas enfermedades bacterianas, se espera que los lantibióticos también puedan servir como un nuevo compuesto principal para remediar este problema alarmante. Principalmente por estas razones, en la década anterior, los lantibióticos han experimentado un notable aumento en actividades de investigación aplicada y básica, lo que conduce a un aumento extraordinario en cuanto al conocimiento acerca de sus propiedades estructurales y funcionales, sus mecanismos de acción y de los genes y componentes proteicos implicados en su biosíntesis y secreción. Por ejemplo, los lantibióticos se han convertido actualmente en objeto de proyectos de “modificación por ingeniería genética de proteínas”, con el objetivo de alterar, mediante mutagénesis dirigida a sitio, su actividad, estabilidad y espectro de células diana susceptibles. En la presente descripción se realiza un enfoque sobre los lantibióticos lineales (tipo A)

ya que hasta el momento se dispone de muy poca información específica acerca de los lantibióticos circulares (tipo B) .

Los lantibióticos subtilina y nisina pertenecen a, y son representativos de, antibióticos peptídicos o lantibióticos de tipo A. Contienen los aminoácidos poco frecuentes deshidroalanina (Dha) , deshidrobutirina (Dhb) , meso-lantionina y 3-metillantionina, y los puentes tioéter característicos. La nisina es el lantibiótico más destacado y se usa como un conservante alimenticio debido a su alta fuerza contra determinadas bacterias Gram-positivas. Las cepas de Lactococcus lactis que pertenecen al grupo serológico N producen nisina. Las fuertes actividades bactericidas de la nisina, y de muchos otros lantibióticos, se basan en su capacidad para permeabilizar la membrana citoplasmática de bacterias diana. La degradación del potencial de membrana comienza por la formación de poros a través de los 45 cuales se liberan moléculas de bajo peso molecular. Además, la nisina inhibe la síntesis de la pared celular uniéndose al lípido II, un precursor de la síntesis del péptidoglucano, modula la actividad de enzimas autolíticas e inhibe el desarrollo de esporas (véase también Breukink y de Kruijf, Biochem. Biophys. Acta 1462:223-234, 1999) .

En muchos países la nisina se usa para impedir el desarrollo de clostridia en queso y en alimentos en conserva. La estructura peptídica de la nisina la describieron primera vez Gross y Morell (J. Am. Chem. Soc. 93:4634-4635, 1971) , y su gen estructural se aisló en 1988 (Buchmann et al., J. Biol. Chem. 263:16260-16266, 1988) . La nisina tiene dos variantes naturales, la nisina A y la nisina Z, que solo se diferencian en un resto de aminoácido en la posición 27 (la histidina en la nisina A se reemplaza por asparagina en la nisina Z) .

La subtilina la produce Bacillus subtilis ATCC 6633. Groos y Kiltz (Biochem. Biophys Res Commun 50: 559-565, 1973) desenmarañaron por primera vez su estructura y en 1988 se aisló su gen structural (Banerjee & Hansen, J. Biol. Chem. 263:9508-9514, 1988) . La subtilina comparte fuertes similitudes con la nisina con una idéntica organización de las estructuras en anillo de la lantionina (Fig. 1) , y ambos lantibióticos poseen similares actividades antibióticas.

Debido a su fácil análisis genético B. subtilis se convierte en un organismo modelo muy adecuado para la identificación y caracterización de genes y proteínas implicados en la biosíntesis de lantibióticos. La ruta mediante la cual se produce la nisina es muy similar a la de la subtilina, y las proteínas implicadas comparten homologías significativas sobre las proteínas completas (para una revisión véase también De Vos et al., Mol. Microbiol. 17:427

437, 1995) .

Otro lantibiótico bien conocido y estudiado, producido por Staphylococcus epidermis 5, es Pep 5, que contiene tres estructuras en anillo (una MeLan y dos Lan) , un resto oxobutirilo N-terminal, y dos restos Dhb (Kellner et al., Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 28:616-619, 1989) .

Los genes respectivos que actúan postraduccionalmente se han identificado adyacentes a genes los estructurales, y juntos se organizan en estructuras de tipo operón (Fig. 2) . Se piensa que estos genes son responsables de la modificación postraduccional, del transporte del prepéptido modificado, de la escisión proteolítica y de la inmunidad que impide efectos tóxicos sobre la bacteria productora. Además de esto, la biosíntesis de la subtilina y de la nisina está fuertemente regulada por un sistema regulador de dos componentes que consiste en una histidina quinasa y una proteína reguladora de respuestas.

De acuerdo con un modelo presente (Fig. 3) se supone que una señal dependiente de la fase de crecimiento extracelular puede activar la histidina quinasa localizada en la membrana. La naturaleza de esta señal puede ser diferente para la biosíntesis de la subtilina y de la nisina. Mientras que en la biosíntesis de la nisina, la propia nisina tiene una función inductora, en la biosíntesis de la subtilina se mostró que esta biosíntesis era dependiente de esporulación.

De acuerdo con el modelo, después de su auto-fosforilación, la histidina quinasa Spak y Nnisk transfiere el resto fosfato al regulador de respuestas que a su vez activa los genes necesarios para la biosíntesis de la subtilina y de la nisina. Por lo tanto, el prepéptido se modifica en un complejo de modificación localizado en la membrana (lantionina sintetasa) que consiste en las proteínas SpaB/SpaC y NisB/NisC intracelulares, respectivamente. De acuerdo con el modelo, estas proteínas también están asociadas con el transportador SpaT y NisT, respectivamente.

Como en cualquier lantibiótico, la molécula de presubtilina o prenisina consta de un segmento líder y un segmento maduro, y se piensa que el segmento líder desempeña diversas funciones en la ruta biosintética. Se piensa que no es sólo una secuencia señal de translocación, sino que proporciona señales de reconocimiento para las enzimas de modificación y para suprimir la actividad antimicrobiana hasta que el péptido maduro se libere de la célula. Como también suponen Qiao y Saris, (Fems Microbiol. Let. 144:89-93 (1996) , el prepéptido modificado es, en el caso de algunos lantibióticos, escindido proteolíticamente después de su transporte a través de la membrana celular, pero en el caso de otros lantibióticos la escisión del líder a partir del péptido modificado se produce dentro de la célula antes de la secreción. En el caso de la nisina, la escisión la realiza NisP, mientras que en el caso de la subtilina no se ha encontrado ninguna proteasa específica dentro de la estructura de tipo operón. Sin embargo, B. subtilis es rica en proteasas extracelulares y posiblemente la subtilisina, que también... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir, en una célula hospedadora, un polipéptido que contiene un puente tioéter, cuyo origen no es una bacteria Gram-positiva, comprendiendo el procedimiento;

a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, en la que

-el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico, y en el que este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que pueda producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias constituido por Ser

Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es un cualquier aminoácido y donde n es 1-13, y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

b) seleccionar la célula hospedadora para detectar la presencia de la proteína transportadora LanT; c) traducir la molécula de ácido nucleico, produciendo de este modo un péptido de fusión del péptido líder de lantibiótico y el polipéptido que comprende la secuencia seleccionada del grupo de secuencias constituido por Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y d) recoger el polipéptido que contiene el puente tioéter de un medio de la célula hospedadora.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende recoger dicho polipéptido deseado 25 después de detectar la presencia de dicho péptido líder en el medio de cultivo de dicha célula.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde dicho polipéptido deseado es de origen esencialmente eucariota o viral.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249 como se indica en la tabla 1A.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde dicho péptido líder se selecciona

del grupo constituido por péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280 como se indica en la tabla 1B. 35

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde dicha célula hospedadora es una célula procariota Gram-negativa o eucariota.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde dicho (poli) péptido que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o formación de un puente tioéter.

8. Un método que permite la modificación de un polipéptido deseado producido por una célula hospedadora recombinante, comprendiendo dicho método las etapas a, b, c y d de la reivindicación 1 y comprendiendo

adicionalmente seleccionar dicha célula hospedadora para detectar la presencia de una enzima capaz de proporcionar modificación postraduccional.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 que permite la modificación extracelular de dicho (poli) péptido deseado comprendiendo adicionalmente dicho método seleccionar dicha célula hospedadora para detectar la presencia de una enzima esencialmente extracelular capaz de proporcionar modificación postraduccional.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 donde dicha enzima es capaz de deshidratar una serina o una treonina.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 donde dicha enzima es capaz de proporcionar la formación de un puente tioéter.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde dicho (poli) péptido deseado es de origen esencialmente eucariota o viral.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 donde dicho péptido líder se selecciona 65 del grupo constituido por péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 donde dicha modificación comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o la formación de un puente tioéter.

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 donde dicha célula hospedadora es 5 una célula procariota Gram-negativa o una célula eucariota.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 donde dicho polipéptido que no ha sufrido modificación postraduccional intracelular comprende la deshidratación de una serina o una treonina y/o la formación de un puente tioéter.

18. Un método para la producción de un polipéptido de origen no lantibiótico que comprende deshidroalaninas y/o restos de ácido deshidrobutírico que comprende:

a) seleccionar una célula hospedadora que tenga una molécula de ácido nucleico que comprenda un primer y un 15 segundo fragmento de ácido nucleico que estén en la misma fase de lectura abierta, donde

-el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que

pueda producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

-y una molécula de ácido nucleico que codifica LanB o la parte N-terminal de LanM y opcionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica LanT;

b) permitir la traducción de dichas moléculas de ácido nucleico; y c) opcionalmente someter a lisis dichas células hospedadoras; y 30 d) recoger dicho polipéptido deseado.

19. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que están en la misma fase de lectura abierta, donde -el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que puede producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan -Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido donde n es 1-13; y donde el polipéptido no tiene como origen una célula bacteriana Gram-positiva;

20. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19 donde dicho polipéptido deseado es de origen 45 esencialmente eucariota o viral.

21. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 donde dicho (poli) péptido se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249.

22. Una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 donde dicho péptido líder se selecciona del grupo que consiste en péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.

23. Una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, siendo dicha célula hospedadora una célula procariota Gram-negativa o una célula eucariota. 55

24. Una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 provista de una proteína LanT y no provista de una proteína LanB.

25. Una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 provista de una proteína 60 LanT y no provista de una proteína LanC.

26. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 25 provista con una LanB.

27. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 23 provista con una proteína LanT, LanB, LanC y/o 65 LanM.

28. Una molécula de ácido nucleico que comprende un primer y un segundo fragmento de ácido nucleico que están en la misma fase de lectura abierta, donde

-el primer fragmento de ácido nucleico codifica un péptido líder de lantibiótico que es funcionalmente equivalente

a un péptido líder N-terminal encontrado en un prepéptido de un lantibiótico y donde este péptido líder actúa como una secuencia señal de translocación y una señal de reconocimiento, de tal manera que puede producirse la formación de un puente tioéter; -el segundo fragmento de ácido nucleico codifica un polipéptido deseado que comprende una secuencia a modificar en un puente tioéter, seleccionándose la secuencia del grupo de secuencias que consiste en Ser-Xaan Cys y Thr-Xaan-Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido y donde n es 1-13; -en el que dicho polipéptido es de origen eucariota o viral.

29. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 donde dicho (poli) péptido se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos con SEC ID Nº: 1 a 249. 15

30. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 o 29, donde dicho péptido líder se selecciona del grupo que consiste en péptidos líder con SEC ID Nº: 250 a 280.