Estabilizador y composición de vacuna que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados.

Un estabilizador para composiciones de vacunas que comprende uno o más flavivirus vivosatenuados,

que comprende, en una solución acuosa sin proteínas de origen animal y sin sales añadidas que tienencationes divalentes,

un tampón,

del 2,5% al 6,5% de sorbitol,

del 2,5% al 13% de sacarosa,

del 0 al 7,5% de trehalosa y/o del 0 al 7,5% de cualquier otro disacárido o trisacárido,

del 0,2% al 0,5% de urea,

del 0,8% al 2,5% de una mezcla de aminoácidos que comprende arginina (Arg), cisteína (Cys-Cys), histidina (His),isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina(Tyr), valina (Val), alanina (Ala), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), prolina(Pro) y serina (Ser).

Estabilizador y composición de vacuna que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados.

La presente invención se refiere a un estabilizador para composiciones de vacuna que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados, a una composición de vacuna a granel estabilizada con este estabilizador, particularmente una composición de vacuna seca preparada de esta composición de vacuna a granel, y a un procedimiento para estabilizar uno o más flavivirus vivos atenuados.

Los flavivirus son un género de virus de la familia Flaviviridae. Este grupo comprende el virus del dengue (DEN) , el virus de la fiebre amarilla (FA) , el virus de encefalitis de Saint Louis, el virus de la encefalitis Japonesa (EJ) y el virus del Nilo Occidental (NO) . Entre estos virus, algunos son inestables.

En el contexto de la presente invención, el término "flavivirus" pretende referirse a cualquier virus de la familia Flaviviridae que es patógeno para los animales, incluyendo mamíferos, en particular flavivirus que son patógenos para los seres humanos. A modo de ejemplos no limitantes, puede hacerse mención a los siguientes flavivirus: serotipos del virus del dengue (DEN) 1, 2, 3 y 4, virus de la encefalitis Japonesa (EJ) , virus de la fiebre amarilla (FA) y virus del Nilo Occidental (NO) .

El término "vivo" se utiliza en su significado convencional, un virus vivo es un virus que no se ha inactivado, es decir, un virus capaz de la replicación en células permisivas.

Un flavivirus vivo atenuado es un flavivirus que no induce la enfermedad causada por el virus de tipo natural correspondiente en animales o seres humanos y que es capaz de inducir una respuesta inmune específica.

A modo de ejemplos no limitantes de los flavivirus vivos atenuados que se pueden utilizar con el estabilizador de acuerdo con la invención, puede hacerse mención a cepas víricas atenuadas, tales como la cepa JEV SA-14-14-2, la cepa YF descrita en el documento US 6589522, las cepas víricas del dengue descritas en la solicitud WO 2006/134433 A1, en particular la cepa VDV1, las cepas descritas en la solicitud WO 2006/134443 A1,

en particular la cepa VDV2; las cepas descritas, por ejemplo, en las solicitudes: WO 02/66621, WO 00/57904, WO 00/57908, WO 00/57909; WO 00/57910, WO 02/095075 y WO 02/102828, y las cepas DEN-1 16007/PDK13, también llamadas "LAV1", DEN-2 16681/PDK53, también llamadas "LAV2" y LAV4, que se describen en la solicitud de patente EP1 159 968 A.

La cepa VDV1 es una cepa obtenida de una cepa DEN-1 de tipo natural 16007 que se ha sometido a 11 pasos en las células PDK (DEN-1 16007/PDK11) y que se amplificó posteriormente en las células Vero a 32 ºC, y cuyo ARN se purificó y se transfectó en células Vero. La cepa VDV-1 tiene 14 mutaciones adicionales en comparación con la cepa vacunal DEN-1 16007/PDK13 (13 pasos en las células de Riñón de Perro Primarias-PDK) . Se proporcionan la secuencia completa y también un procedimiento de preparación y la caracterización de la cepa VDV-1 en la solicitud WO 2006/134433 A1. La cepa se puede reproducir fácilmente en base a esta enseñanza.

La cepa VDV-2 es una cepa obtenida de una cepa DEN-2 de tipo natural 16681 que se ha sometido a 50 pasos en la células PDK (DEN-2 16681/PDK50) , placa purificada y cuyo ARN se extrajo y se purificó antes de transfectarse en las células Vero. La cepa VDV-2 se obtuvo posteriormente por la purificación de placa y

amplificación en las células Vero. La cepa VDV-2 tiene 10 mutaciones adicionales en comparación con la cepa vacunal DEN-2 16681/PDK53 (53 pases en las células PDK) . Se dan la secuencia completa y también un procedimiento de preparación y la caracterización de la cepa VDV-2 en la solicitud WO 2006/134443 A1. Dicha cepa se puede reproducir fácilmente en base a esta enseñanza.

Entre los flavivirus vivos atenuados que se pueden utilizar con el estabilizador de acuerdo con la invención, también puede hacerse mención, de un modo no limitante, a virus quiméricos tales como: los virus quiméricos descritos, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 93/06214 y también el ChimeriVax™. El término "ChimeriVax™" o "CYD" representa un virus de la fiebre amarilla (FA) quimérico que comprende la cadena principal de un virus de la FA en el que las secuencias codifican la premembrana y las proteínas envueltas se han 55 reemplazado por las secuencias correspondientes de cualquier cepa de un flavivirus diferente, por ejemplo de un virus del dengue (DEN) , de un virus de la encefalitis Japonesa (EJ) o de un virus del Nilo Occidental (NO) . La construcción de estos ChimeriVax™ se ha descrito en detalle en las solicitudes de patente internacional WO 98/37911 y WO 03/101397, a las que puede hacerse referencia para una descripción precisa del procedimiento para su preparación. Se proporciona una revisión en los flavivirus quiméricos vivos atenuados que se pueden usar en el contexto de la presente invención por C-J. Lai y T. P. Monath in "Advances in Virus Research", (2003) vol. 61, páginas 469 a 509.

Un virus de la FA quimérico que contiene las secuencias prM y E de una cepa de serotipo 1 de dengue (DEN-1) se denomina de este modo CYD-1 o CYD DEN1. Un virus de la FA quimérico que contiene las secuencias prM y E de una cepa DEN-2 se denomina CYD-2 o CYD DEN2. Un virus de la FA quimérico que contiene las secuencias prM y E de una cepa DEN-3 se denomina CYD-3 o CYD DEN3. Un virus de la FA quimérico que contiene las secuencias prM y E de una cepa DEN-4 se denomina CYD-4 o CYD DEN4. Un virus quimérico del dengue puede ser, por ejemplo, DEN-1 de ChimeriVax™, en particular un virus YF17D/DEN-1, o también un DEN-2

de ChimeriVax™, en particular un virus YF17D/DEN-2, un DEN-3 de ChimeriVax™, en particular un virus YF17D/DEN-3, o un DEN-4 de ChimeriVax™, en particular un virus YF17D/DEN-4. Las quimeras descritas en los ejemplos se generaron usando las secuencias prM y E derivadas de las cepas DEN 1 PU0359 (TVP1140) , DEN2 PU0218, DEN3 PaH881/88 y DEN4 1228 (TVP 980) .

Preferiblemente, el virus de la FA quimérico comprende la cadena principal de una cepa de la fiebre amarilla atenuada YF17D (Theiler M, y Smith HH (1937) J Exp. Med 65, páginas 767-786) (virus YF17D/DEN-1, YF17D/DEN-2, YF17D/DEN-3, YF17D/DEN-4) . Los ejemplos de las cepas YF17D que se pueden usar incluyen YF17D204 (YF-Vax®, . Sanofi-Pasteur, Swifwater, PA, Estados Unidos; Stamaril®, Sanofi-Pasteur, Marcy I'Etoile, Francia; ARILVAXMR, Chiron, Speke, Liverpool, Reino Unido; FLAVIMUN®, Berna Biotech, Bern, Suiza; YF17D-204

France (X15067, X15062) ; YF17D-204.234 Estados Unidos (Rice y col., 1985, Science, 229: 726-733) , o también las cepas relacionadas YF17DD (número de acceso al Genbank U17066) , YF17D-213 (número de acceso al Genbank U17067) y las cepas YF17DD descritas por Galler y col., (1998, Vaccines 16 (9/10) : 1024-1028) . Cualquier otra cepa del virus de la fiebre amarilla atenuada que se puede utilizar en humanos se puede usar para la construcción de las quimeras. Estas mismas cepas de la fiebre amarilla pueden usarse como tales con el estabilizador de acuerdo con la invención para la preparación de una composición que se puede usar en el contexto de una inmunización contra la fiebre amarilla.

Las quimeras en las que el vector es un virus del dengue, como se describe, por ejemplo, en las solicitudes de patente WO 96/40933 y WO 01/60847, también se pueden usar con el estabilizador de acuerdo con la invención.

También se describen diferentes realizaciones de los virus quiméricos en las solicitudes WO 02/102828; WO 03/103571; WO 02/072835; WO 2004/045529; WO 2005/082020, cuyos virus también se pueden usar con el estabilizador de acuerdo con la presente invención.

Además, en el contexto de la invención, también pueden usarse los vectores quiméricos que se han descrito anteriormente en los que las secuencias heterólogas insertadas son secuencias como se describen en la solicitud WO 03/102166.

Los virus quiméricos tienen la particularidad de exhibir las características de los virus vivos atenuados como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, es posible usar, en el contexto de la invención, cualquier virus quimérico que expresa la proteína de envoltura o uno o más epítopos de una o más proteínas de envoltura de uno o más flavivirus y que induce una respuesta inmune específica que comprende anticuerpos que neutralizan la cepa, o al menos una de las cepas, a partir de lo cual se deriva la proteína de envoltura o el epítopo.

En el contexto de la presente invención, la expresión "composición de vacuna a granel" pretende referirse a una composición que sale de la etapa final de la producción de antígeno, purificada... [Seguir leyendo]

1. Un estabilizador para composiciones de vacunas que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados, que comprende, en una solución acuosa sin proteínas de origen animal y sin sales añadidas que tienen cationes divalentes,

un tampón,

del 2, 5% al 6, 5% de sorbitol,

del 2, 5% al 13% de sacarosa,

del 0 al 7, 5% de trehalosa y/o del 0 al 7, 5% de cualquier otro disacárido o trisacárido, 10 del 0, 2% al 0, 5% de urea,

del 0, 8% al 2, 5% de una mezcla de aminoácidos que comprende arginina (Arg) , cisteína (Cys-Cys) , histidina (His) ,

isoleucina (Ile) , leucina (Leu) , lisina (Lys) , metionina (Met) , fenilalanina (Phe) , treonina (Thr) , triptófano (Trp) , tirosina (Tyr) , valina (Val) , alanina (Ala) , asparagina (Asn) , ácido aspártico (Asp) , ácido glutámico (Glu) , glicina (Gly) , prolina (Pro) y serina (Ser) .

2. El estabilizador como se ha indicado en la reivindicación 1, que comprende uno o más tampones seleccionados entre el grupo que comprende TRIS (tris (hidroximetil) -aminometano) , HEPES (ácido 2- (4- (2hidroxietil) -1-piperazinil) etano-sulfónico) y fosfato potásico y/o fosfato sódico.

3. El estabilizador como se ha indicado en la reivindicación 2, en el que TRIS está presente a una concentración de 5 a 10 mM.

4. El estabilizador como se ha indicado en la reivindicación 2, en el que el HEPES está presente a una concentración de 7, 5 a 20 mM. 25

5. El estabilizador como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende 3, 8% (p/v) de sorbitol, 7, 5% (p/v) de sacarosa, 5, 5% (p/v) de trehalosa,

0, 25% (p/v) de urea y 1, 5% (p/v) de la mezcla de aminoácidos.

6. Una composición de vacuna acuosa a granel estabilizada que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados y el estabilizador como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 1 a 5. 35

7. La composición como se ha indicado en la reivindicación 6, que comprende uno o más serotipos vivos atenuados del virus del dengue (DEN) .

8. La composición como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 ó 7, que comprende virus 40 vivos atenuados de la fiebre amarilla (FA) .

9. La composición de vacuna como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 u 8, que comprende virus vivos atenuados de la enfermedad del virus del Nilo Occidental (NO) .

10. La composición de vacuna como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende virus vivos atenuados de la encefalitis Japonesa (EJ) .

11. La composición de vacuna como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 a 10, que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados quiméricos. 50

12. La composición de vacuna como se ha indicado en la reivindicación 11, que comprende uno o más serotipos de un virus FA-DEN (fiebre amarilla-dengue) quimérico.

13. La composición de vacuna como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 11 a 12, que 55 comprende un virus FA-NO (fiebre amarilla-virus del Nilo Occidental) quimérico.

14. La composición de vacuna como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende un virus FA-EJ (fiebre amarilla-encefalitis Japonesa) .

15. La composición de vacuna como se ha indicado en la reivindicación 6 que es una composición tetravalente que comprende CYD-1, CYD-2, CYD-3 y CYD-4.

16. Un procedimiento para estabilizar uno o más flavivirus vivos atenuados, que comprende la dilución de

un cultivo viral purificado y concentrado que comprende uno o más flavivirus vivos atenuados añadiendo estabilizador para obtener las concentraciones finales de los componentes de estabilizador que se han definido en las reivindicaciones 1 a 5 con el fin de obtener una composición como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 a 15.

17. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en la reivindicación 16, que comprende secar la composición acuosa por medio de un procedimiento seleccionado entre el grupo de secado por espuma, secado por pulverización o secado por espuma y liofilización.

18. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en la reivindicación 16, que comprende secar 15 la composición acuosa por medio del procedimiento de liofilización.

19. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en la reivindicación 16, que comprende secar la composición acuosa por medio del procedimiento de secado por pulverización-liofilización.

20. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en el que, en una primera etapa, la solución acuosa se congela en forma de partículas uniformes o de perlas, y en el que, en una segunda etapa, las partículas uniformes o perlas congeladas se someten a secado para obtener un producto seco estabilizado en forma de partículas uniformes o de perlas.

21. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en la reivindicación 20, en el que las partículas uniformes o perlas del producto seco estabilizado tienen un diámetro de aproximadamente 100 μm a 1500 μm.

22. El procedimiento de estabilización como se ha indicado en la reivindicación 21, en el que las partículas uniformes o perlas del producto seco estabilizado tienen un diámetro de aproximadamente 500 μm a 1000 μm. 30

23. Una composición de vacuna seca obtenida mediante el secado de la composición a granel estabilizada como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 a 15.

24. La composición de vacuna seca como se ha indicado en la reivindicación 23, que está presente en 35 forma de partículas uniformes o de perlas.

25. La composición de vacuna seca como se ha indicado en la reivindicación 24, en la que cada partícula o cada perla contiene una mezcla de diversos flavivirus vivos atenuados y/o vivos atenuados quiméricos.

26. La composición de vacuna seca como se ha indicado en la reivindicación 24, en la que cada partícula o cada perla contiene flavivirus vivos atenuados y/o vivos atenuados quiméricos de un único tipo.

27. Una composición de vacuna seca preparada a partir de la composición a granel estabilizada como se ha indicado en una o más de las reivindicaciones 6 a 15. 45

28. Un procedimiento para preparar una vacuna, que comprende la etapa de reconstituir la composición como se ha indicado en una de las reivindicaciones 23 a 27 con una solución acuosa.

29. Un kit de vacuna contra los flavivirus que comprende un primer recipiente que contiene la composición

de vacuna seca como se ha indicado en una de las reivindicaciones 23 a 27 y un segundo recipiente que contiene una solución acuosa para reconstituir la vacuna.

30. El kit como se ha indicado en la reivindicación 29, en el que el primer recipiente contiene una mezcla de las diversas composiciones de vacunas que se han indicado en la reivindicación 26. 55