Entrega dirigida de proteínas de Factor VIII a plaquetas.

Molécula de FVIII que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la parte madura de una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEC ID nº:

1 y SEC ID nº: 3, esta molécula está fijada de manera covalente a una molécula específica de las plaquetas, donde dicha molécula específica de las plaquetas es un anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria.

Entrega dirigida de proteínas de Factor VIII a plaquetas Campo de la invención [0001] La invención descrita en este documento se refiere a polipéptidos que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad significativa con (homología con) el Factor VIII humano o una parte o partes biológicamente activas del mismo, moléculas relacionadas (tales como los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos) , composiciones (tales como formulaciones farmacéuticas) que comprenden tales polipéptidos y métodos de fabricación y uso de tales polipéptidos y moléculas biológicas relacionadas.

Antecedentes de la invención [0002] El Factor VIII de coagulación ("Factor VIII" o "FVIII") es un factor de coagulación esencial. La falta de FVIII normal provoca hemofilia A, un trastorno de la sangre hereditario. El Factor VIII participa en la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea. Específicamente, el Factor VIII es un cofactor para el Factor IXa, que convierte el Factor X en el Factor Xa activado (en presencia de Ca+2 y fosfolípidos) .

El gen del Factor VIII produce dos transcritos empalmados alternativamente. La variante del transcrito 1 codifica una glicoproteína grande, isoforma A, que circula en el plasma y se asocia con el factor de von Willebrand ("vWF") en un complejo no covalente. Esta proteína sufre múltiples eventos de escisión. La variante del transcrito 2 codifica una proteína pequeña putativa, isoforma B, que consiste principalmente en el dominio de unión a fosfolípidos del factor VIIIc. Este dominio de unión es esencial para la actividad coagulante. La estructura del FVIII es bien conocida (véase, por

ejemplo, Thompson, Semin Thromb Hemost. 2003 Feb;29 (1) :11-22) .

Tras la activación por trombina, (Factor IIa) , el Factor VIIIa (FVIIIa) se disocia del complejo FVIII:vWF para interactuar con el Factor IXa causando una cadena bien caracterizada de eventos que llevan a la producción de más trombina. La trombina escinde el fibrinógeno en fibrina que se polimeriza y reticula (usando el Factor XIII) en un coágulo sanguíneo. El FVIIIa es proteolíticamente inactivado en este proceso por la Proteína C activada ("aPC") y el Factor IXa y se elimina rápidamente del flujo sanguíneo.

El FVIII concentrado a partir de plasma sanguíneo donado o alternativamente FVIII recombinante se puede dar a los hemofílicos para restaurar la hemostasis. Así, el FVIII también se conoce como factor antihemofílico.

El FVIII tiene una vida media circulatoria de aproximadamente 10-12 horas in vivo y por lo tanto es altamente deseable proporcionar análogos de FVIII con una vida media prolongada para reducir la frecuencia de las infusiones de FVIII IV terapéuticas/profilácticas. Neymal et al. (Neyman M et al., "Analysis of the spatial and temporal characteristics of platelet-delivered factor VIII-based clots", Blood, vol. 112, no. 4, páginas 1101-1108) revelan un método donde el Factor

VIII se dirige a las plaquetas vía su expresión ectópica.

La W02009140598 divulga un concepto que incluye moléculas híbridas que comprenden anticuerpos específicos de FVIII y GPIIb/IIIa. Este concepto puede, no obstante, suponer inhibición de la capacidad de los receptores GPIIb/IIIa para enlazar fibrinógeno y la capacidad para formar un coágulo primario disminuirá así al administrar tales moléculas de 45 FVIII híbridas. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de moléculas de Factor VIII biológicamente activas con una capacidad para enlazar a plaquetas con alta afinidad. Además, existe una necesidad en la técnica de moléculas de Factor VIII biológicamente activas con una capacidad para enlazar a plaquetas mientras se mantiene esencialmente la capacidad de las plaquetas para agregar y formar así un coágulo primario.

Resumen de la invención [0008] La presente invención, en su forma más amplia, proporciona una molécula de FVIII que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la parte madura de una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEC ID nº: 1 y SEC ID nº: 3, esta molécula se fija de manera covalente a una molécula específica de 55 las plaquetas, donde dicha molécula específica de las plaquetas es un anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación de plaquetas (como se hace referencia en la reivindicación independiente 1) . La presente solicitud también proporciona un ácido nucleico que codifica para este tipo de molécula, una célula huésped que comprende dicha molécula de ácido nucleico al igual que un método para producir tal molécula de FVIII, una composición farmacéutica que comprende tal molécula de FVIII y el uso de tal molécula de FVIII como medicamento para el tratamiento de la hemofilia A (como se 60 define en las reivindicaciones independientes) . Las formas de realización preferibles se definen en las reivindicaciones dependientes.

Estos y otros aspectos, características y ventajas de la invención se describirán más detalladamente en la presente.

Descripción de los dibujos [0010]

La figura 1 ilustra métodos potenciales por los que una scFv se puede unir químicamente a cis o expresar en cis como parte del polipéptido con una secuencia de aminoácidos análoga de FVIII o de FVIII para obtener una molécula de FVIII modificada. Se muestran específicamente la glicoconjugación, la conjugación química y los métodos de proteína de fusión para la producción de tal molécula. Estos métodos se pueden usar de forma similar, donde sea adecuado, para generar otras moléculas de FVIII de la invención.

La figura 2 ilustra la agregación plaquetaria. Las barras muestran la agregación en las plaquetas activadas SFLLRN (10 μM) pretratadas con F8-500 AP3-LC-HC scFV-Δa3 (AP3-N8) o ReoPro®. Se muestran datos como error estándar de la media de determinaciones duplicadas en las que SFLLRN (10 μM) solo se estableció como 100 %.

La figura 3 ilustra el vector dirigido final.

La figura 4 ilustra la unión de AP3-N8 2097 (A) y AP3-N8 MZ1 (C) a plaquetas humanas de manera dosisdependiente. La unión de ambos compuestos se puede completar casi completamente con AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEC ID nº 21) en exceso.

Descripción de la invención [0011] En el contexto de esta invención, una proteína de Factor VIII (o proteína de FVIII) es una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que muestra al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de Factor VIII humano (SEC ID nº: 1) o la parte madura de la misma (es decir, los residuos 20-2351 de la misma) , o la parte activada de trombina de la misma, o una versión con el dominio B eliminado/truncado de la misma, como se muestra más adelante.

Factor VIII (SEC ID nº: 1)

Factor VIII con el dominio B eliminado (SEC ID nº: 2) [0013]

Factor VIII con el dominio B truncado ("N8") (SEC ID nº: 3)

En un aspecto más particular, la invención se refiere a derivados de FVIII dirigidos que muestran al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% de identidad con la SEC ID nº: 1 o la parte madura o la parte activada de trombina de la misma, o una versión con el dominio B eliminado/truncado de la misma.

En otro aspecto más particular, la invención se refiere a derivados de FVIII dirigidos que muestran al menos aproximadamente 90% de identidad (tal como al menos aproximadamente 93% de identidad) con SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, o la parte madura o la parte activada de trombina de la misma, o una versión con el dominio B eliminado/truncado de la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona derivados de FVIII dirigidos que muestran al menos aproximadamente 95% de identidad con SEC ID nº: 1 o la parte madura o la parte activada de trombina de la misma. En aspectos más particulares, la invención proporciona derivados de FVIII dirigidos que muestran al menos aproximadamente 96%, al 20 menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 98, 5%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99, 5%, o al menos aproximadamente 99, 7%, al menos aproximadamente 99, 8%, o incluso al menos aproximadamente 99, 9% de identidad con SEC ID nº: 1 o la parte madura de la misma, o la parte activada de trombina de la misma, o una versión con el domino B eliminado/truncado de la misma. Dicho de otra manera, en un aspecto, la invención proporciona derivados de FVIII dirigidos caracterizados por el hecho de que incluyen una secuencia de aminoácidos en la que al menos 1, típicamente al menos 2-3, frecuentemente al menos... [Seguir leyendo]

1. Molécula de FVIII que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la parte madura de una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEC ID nº: 1 y SEC ID nº: 3, esta molécula está fijada de manera covalente a una molécula específica de las plaquetas, donde dicha molécula específica de las plaquetas es un anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria.

2. Molécula de FVIII según la reivindicación 1, donde dicha molécula tiene una capacidad reducida de enlace al vWF.

3. Molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la molécula es una proteína de fusión.

4. Molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria está fijado de manera covalente al FVIII vía un enlazador.

5. Molécula de FVIII según la reivindicación 4, donde el enlazador comprende un glicano N-enlazado o un glicano Oenlazado sobre la molécula de FVIII.

6. Molécula de FVIII según la reivindicación 5, donde el glicano está colocado en el dominio B.

7. Molécula de FVIII según la reivindicación 3, donde el anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria está fusionado al dominio B de una molécula de Factor VIII con el dominio B truncado.

8. Molécula de FVIII según la reivindicación 3, donde el dominio a3 de la molécula de FVIII está sustituido por el anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria.

9. Molécula de FVIII según la reivindicación 6, donde la molécula de FVIII comprende la secuencia tal y como se presenta en SEC ID nº 3, y donde el enlazador comprende un glicano O-enlazado colocado en el dominio B.

10. Ácido nucleico que codifica una molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

11. Célula huésped que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Método para producir una molécula de FVIII, dicho método comprende la expresión del ácido nucleico según la reivindicación 10 en una célula huésped según la reivindicación 11.

13. Método para producir una molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 6 y 9, donde dicho método comprende la conjugación de la molécula de FVIII con el anticuerpo GPIIb/IIIa que no inhibe la agregación plaquetaria.

14. Composición farmacéutica que comprende una molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

15. Molécula de FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un método para el tratamiento de la hemofilia A.