Un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra,

caracterizado porque uno o más alergenos únicos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra se incuba con los alergenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas de los alergenos se unen al alergeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas que está unidas a los alergenos inmovilizados específicos.

Procedimiento de ensayo de alergenos con micromatrices.

La presente invención trata de un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra, así como a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en un paciente.

Una alergia es una reacción producida por el sistema inmunológico del organismo a una sustancia que normalmente se consideraría como inocua. Es esta respuesta la que causa los síntomas que se clasifican como reacciones alérgicas. Por tanto, la alergia no es un fallo del sistema inmunológico sino que es una sobreactividad del mismo. La respuesta de una persona alérgica a un alergeno puede producir un amplio abanico de síntomas. Algunas personas sufren síntomas tales como asma, eczema, exantemas, picor de ojos, sinusitis, nariz tapada o rinorrea y fiebre del heno, sin embargo se pueden producir síntomas más serios. Con alergias tales como, por ejemplo, las que se producen frente a los venenos, las nueces y los mariscos se puede producir un estado potencialmente mortal denominado choque anafiláctico. Esto sucede cuando el cuerpo produce una reacción tan intensa que la garganta se inflama, la presión arterial disminuye y la persona tiene dificultades para respirar. En algunos casos, este tipo de reacción puede ser mortal.

En los países desarrollados, la incidencia de alergias es cada vez mayor (es decir, en Europa, Norteamérica y Japón). Se ha estimado que afecta a un intervalo del 20-50% de la población. En la actualidad se sabe que las alergias son el resultado de un desequilibrio en el compartimento de las células T del sistema inmunológico. Más exactamente, las alergias se acompañan de un aumento de la actividad de las células T denominadas colaboradoras de tipo 2 (Th2) con respecto a las células T colaboradoras de tipo 1 (Th1), lo que da lugar a un incremento de la producción de IgE.

La IgE (inmunoglobulina E) es al menos una de las sustancias que causan reacciones alérgicas. La IgE específica de un alergeno normalmente no se detecta en sangre y sólo se produce cuando una persona se sensibiliza frente a una sustancia. Las sustancias que causan alergia (Denominadas alergenos) producen una IgE específica que es única y sólo reaccionara con su alergeno. Esta reacción entre la IgE y el alergeno es como una llave y una cerradura. La IgE, cuando se combina con el alergeno, hace que las células liberen sustancias químicas (por ejemplo histamina) que producen síntomas de alergia. Una persona puede tener IgE específica de más de una sustancia y puede, por tanto, ser alérgica a más de una sustancia. Los resultados de una prueba de IgE se expresan cono un grado que indica cuánta cantidad de IgE específica de la sustancia que se está probando está presente en la sangre. Cuanto más elevado es el grado, la probabilidad de que el paciente sea alérgico es mayor. Durante las últimas décadas las enfermedades alérgicas se han diagnosticado usando extractos purificados sólo ligeramente derivados de las fuentes principales de alergenos. Obviamente, estas mezclas en bruto son complejas y de composición variable. Como consecuencia de ello, el potencial diagnóstico de estos extractos puede variar y conducir a la producción de resultados falsos negativos. Esto último se ha atribuido principalmente a la inestabilidad de los alergenos en los extractos. Otro inconveniente del uso de extractos en el diagnóstico de las alergias es la mala normalización de los productos disponibles en el mercado en relación con su composición alergénica. Las unidades de expresión de la potencia y los métodos de cálculo son diferentes para cada empresa del mercado. Como consecuencia, apenas se pueden comparar productos diagnósticos procedentes de distintas empresas.

Durante las últimas décadas se han identificado los componentes más importantes relacionados con la enfermedad, los alergenos mayoritarios, aunque su cuantificación no se usa como base para la normalización de los extractos de alergenos. En la actualidad se dispone de anticuerpos monoclonales frente a la mayoría de los alergenos mayoritarios.

La prueba de alergia según procedimientos conocidos no es un procedimiento directo. Estos procedimientos pueden ser procedimientos útiles siempre que se conozca el historial del paciente para poder identificar las pruebas que serán más adecuadas. Sin embargo, sólo hay algunas pruebas médicas reconocidas que puedan identificar alergias y, como norma general, su uso se ha restringido a laboratorios clínicos o a centros especialistas. Aunque el diagnóstico de atopia o alergia por parte de un médico experto o de un alergólogo puede establecerse con facilidad, a menudo se requieren más pruebas para confirmarlo.

Existen varios tipos de pruebas de alergia:

1. Prueba de la punción cutánea

Los alergenos a los que se sospecha que el paciente es alérgico se inyectan justo debajo de la superficie de la piel y un profesional de enfermería o médico experto observará la reacción. A medida que la reacción se desarrolla aparece una zona enrojecida, cuanto más fuerte es la reacción, mayor es la zona. La prueba cutánea es bastante sensible, aunque no todas las alergias se pueden identificar mediante este procedimiento.

2. Prueba con parches

La prueba con parches puede ser muy útil en los casos de dermatitis de contacto. Por lo general, las sustancias que se van a probar se aplican a la piel cubiertas por un parche y se deja en el sitio durante 48 horas. Una reacción positiva produce una pequeña zona de eccema. De nuevo, un profesional de enfermería o médico experto observará la reacción.

3. Prueba de alergia alternativa

Hay muchos tipos alternativos de pruebas de alergia y, por desgracia, pocas son exactas o están reconocidas por la profesión médica. Estas pruebas alternativas a menudo conducen a confusiones y son caras.

4. Prueba de Vega

La prueba de Vega es una prueba eléctrica que se describe como una técnica reguladora bioenergética. La máquina mide la conductividad con un circuito Wheatstone. Los electrodos se conectan a puntos de acupuntura o se dejan en la mano del paciente, Después se colocan soluciones diferentes en una bandeja metálica. A continuación, la máquina se calibra mediante la colocación en la bandeja de un vial de vidrio con una sustancia tóxica. El vial produce una reducción de la conductividad eléctrica. Después se colocan en la bandeja otras sustancias y si proporciona una lectura similar se registra como una reacción alérgica o de sensibilidad. Esta técnica se usa mucho en almacenes de alimentos sanos, sin embargo su valor no se ha probado y no hay estudios válidos que sostengan las reclamaciones

5. Prueba leucocitotóxica

La prueba leucocitotóxica implica mezclar los leucocitos del paciente con un extracto de alimento específico y después medir las células de varias formas para detectar signos de alguna forma de cambio, Se produce un número elevado de reacciones falsos positivos y falsos negativos y la Academia Americana de Alergias (American Academy of Allergy) concluyó que no había signos de que la prueba fuera eficaz para el diagnóstico de alergias a alimentos o inahalante.

6. Análisis del pelo

Otra forma de prueba es el análisis del pelo. El pelo se puede analizar para determinar la presencia de metales tóxicos tales como plomo, mercurio y cadmio o niveles bajos de selenio, cinc, cromo, manganeso y magnesio. El envenenamiento por metales pesados está bien reconocido y documentado en la ciencia forense y el análisis del pelo puede indicar exposición a metales. Sin embargo, los análisis del pelo como medio para diagnosticar alergias, mediante procedimientos como radiestesia, nunca se han validado.

7. Kinesiología aplicada

Se toman muestras de alimentos y se colocan debajo de la lengua del paciente o en su mano dentro de un recipiente de vidrio. A continuación se pide al paciente que empuje su brazo libre contra el brazo del médico que está realizando la prueba. SI se detecta una respuesta alérgica, esta se manifiesta como una reducción de la respuesta muscular y el paciente experimenta dificultad para levantar el brazo. Esta técnica no resiste un estudio a doble ciego.

Además, existen varios procedimientos in vitro para diagnosticar alergias que detectan la presencia de anticuerpos IGE o IgG en la sangre de un paciente.

8. Los procedimientos convencionales tales como ELISA o técnicas Western blot...

1. Un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra, caracterizado porque uno o más alergenos únicos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra se incuba con los alergenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas de los alergenos se unen al alergeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas que está unidas a los alergenos inmovilizados específicos.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las IgE se detectan como inmunoglobulinas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las IgG se detectan como inmunoglobulinas.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más alergenos recombinantes.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más alergenos producidos de forma sintética.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más haptenos como alergenos.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en puntos de 10 a 2000 μm de diámetro en el chip micromatriz.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en puntos de 50 a 500 μm de diámetro, preferentemente un diámetro de 150-250 μm en el chip micromatriz.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en un soporte sólido como el chip micromatriz.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en vehículo de vidrio y sintético, respectivamente, como el chip micromatriz.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en una oblea de silicio, como el chip micromatriz.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en una membrana, como el chip micromatriz.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el chip micromatriz está químicamente modificado, preferentemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los alergenos están unidos de forma covalente al chip micromatriz.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque las inmunoglobulinas se detectan en suero sanguíneo como la muestra.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el suero sanguíneo está diluido a 1:a-1:15, preferentemente a 1:5.

17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la muestra se incuba con los alergenos de 1 minuto a 24 horas, preferentemente de 1 a 2 horas.

18. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la muestra se incuba con los alergenos a una temperatura de entre 0 y 60ºC, preferentemente a 37ºC.

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado.

20. El procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado con fluorescencia.

21. El procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado radiactivo.

22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más alergenos de interior se inmovilizan como alergenos.

23. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más alergenos de exterior se inmovilizan como alergenos.

24. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más alergenos de alimentos se inmovilizan como alergenos.

25. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más alergenos de venenos se inmovilizan como alergenos.

26. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más autoalergenos se inmovilizan como alergenos.

27. Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en un paciente, caracterizado porque se toma una muestra de suero de un paciente, tras lo cual la muestra se analiza para determinar las inmunoglobulinas que se unen a alergenos según un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde se usa un chip micromatriz sobre el cual se inmovilizan al menos 10, preferentemente al menos 50, todavía más preferentemente al menos 90, alergenos diferentes, tras lo cual se diagnostica una reacción positiva entre la muestra y los alergenos inmovilizados como una alergia.

28. Chip micromatriz en el que se inmovilizan uno o más alergenos únicos purificados.

29. El chip micromatriz según la reivindicación 28, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en un punto de un diámetro de 100-500 μm, preferentemente un diámetro de 200-300 μm.

30. El chip micromatriz según la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque es un soporte de vidrio.

31. El chip micromatriz según la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque es un soporte sintético.

32. El chip micromatriz según la reivindicación 28 ó 29, caracterizada porque es una oblea de silicio.

33. El chip micromatriz según la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque es una membrana.

34. El chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque está modificado químicamente, preferentemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.

35. El chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, caracterizado porque los alergenos están covalentemente unidos a él.

36. Un kit, caracterizado porque comprende un chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35 y un primer reactivo que comprende al menos un reactivo detector de inmunoglobulinas, preferentemente un anticuerpo antiinmunoglobulina, preferentemente a una concentración conocida, y posiblemente un segundo reactivo como muestra positiva que comprende al menos una inmunoglobulina que se une a un alergeno.

37. El kit según la reivindicación 36 para llevar a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.