Ensamblaje molecular que comprende oro y un engarce para detección de entidades bioquímicas.

Ensamblaje molecular que comprende un ligando, un engarce y una entidad detectable,

en el que el ligando estáunido covalentemente al engarce, y el engarce es un agente quelante que forma un complejo de coordinación con laentidad detectable, caracterizado porque la entidad detectable comprende partículas de oro, y porque el agentequelante tiene la estructura química

en la que R1, R2, R3, R4 pueden ser iguales o diferentes, en la que R1-R4 se seleccionan del grupo que consiste en-SH, -NH2, -COOH, hidrocarburos C1-C20 que incluyen o se sustituyen con al menos un grupo funcional quecomprende al menos un heteroátomo, y n ³ 1, caracterizado además porque el ligando se selecciona de un grupode especies químicas que incluye proteínas, péptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, hormonas,antígenos solubles, carbohidratos, polisacáridos, ADN, ARN y lípidos, en los que las partículas de oro tienencationes divalentes unidos a ellas para mostrar de este modo sitios reactivos para formar un complejo decoordinación con el agente quelante.

Ensamblaje molecular que comprende oro y un engarce para detección de entidades bioquímicas Campo de la invención La presente invención se refiere a un ensamblaje molecular que comprende un ligando, un engarce y una entidad detectable, en el que el ligando está unido covalentemente al engarce, y el engarce es un agente quelante que forma un complejo de coordinación con la entidad detectable.

Antecedentes de la invención Hace 50 años se prepararon anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes para la primera detección por microscopía de antígenos en tejidos. En 1970 los marcadores enzimáticos proporcionaron por primera vez una tinción coloreada permanente con mayor resolución y mayor estabilidad que los marcadores fluorescentes. Mediante la introducción de los marcadores de oro en la microscopía en 1971, los marcadores de oro se han hecho muy importantes para la detección y cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos cuando se usan en técnicas tales como transferencia, citometría de flujo, hibridación e identificación de huella de ADN. Entre los coloides metálicos, el oro sigue siendo uno de los reactivos más ampliamente usados con una historia que data desde Faraday en 1857. El documento RU 201374 describe la síntesis de partículas de oro de átomos de oro y su conjugación con estreptavidina.

La estabilidad, sensibilidad y reproducibilidad superior de la fabricación hacen al oro adecuado para su uso en varias aplicaciones. En el microscopio electrónico las partículas de oro son visibles sin tratamiento adicional. En el microscopio óptico, sin embargo, las partículas de oro se hacen visibles a través de un procedimiento de potenciación de plata corto y sencillo. Para la detección por el ojo, las partículas de oro también revelerán proteína inmovilizada en una fase sólida tal como membrana de transferencia a través del color rojo acumulado del sol de oro. La potenciación con plata de este precipitado de oro también proporciona sensibilidad para detección aumentada.

Con la correcta química de conjugación pueden acoplarse partículas de oro con una amplia diversidad de moléculas incluyendo proteínas (por ejemplo anticuerpos) , polipéptidos, carbohidratos, polímeros, polisacáridos, enzimas y ácidos nucleicos.

Hay varias ventajas en la selección de partículas de oro como marcadores para identificación microscópica y no microscópica de moléculas diana. La abundancia de diferentes tamaños de partícula de los que elegir hace posible estudiar los antígenos de forma microscópica sobre una amplia serie de aumentos y proporciona la oportunidad de marcaje múltiple de antígenos en secciones tisulares. Aunque los marcadores fluorescentes y las reacciones de color basadas en enzimas pueden desteñirse con el tiempo y la exposición a la luz, las partículas de oro no desaparecen, las partículas de oro proporcionan un marcador permanente. A diferencia de algunos sistemas de detección basados en enzimas, las sondas de oro son esencialmente no tóxicas, seguras y fáciles de usar. La buena estabilidad de un conjugado de oro bien hecho proporciona al producto un largo periodo de caducidad tanto congelado como almacenado a 4 ºC.

Para tinción de proteínas inmovilizadas en membranas, las sondas de oro tienen sensibilidad y resolución de detección inmejorable. Además las sondas de oro no son caras en su aplicación y su alta sensibilidad con frecuencia permite que se diluyan anticuerpos primarios valiosos significativamente más que lo que es posible con el uso de otros sistemas de detección.

Se ha sintetizado previamente grupos de oro en el intervalo de 1, 4 nm, listos para conjugación covalente de ligandos, con dos químicas de superficie diferentes (superficies de Maleimido y sulfo –N-hidrosuccinimida) . Sin embargo las desventajas asociadas con estos grupos de oro son: 1) sus pequeños tamaños requieren potenciación con plata en todos los tipos de aplicaciones, 2) las moléculas reactivas en su superficie actúan a un pH mayor de 8, 0, esta propiedad dificulta su uso con biomoléculas que tengan puntos isoeléctricos bajos, 3) moléculas mayores (tales como IgM) son incapaces de unirse al grupo de oro debido a impedimento estérico. Además los grupos de oro son difíciles de producir puesto que deben sintetizarse los componentes del reactivo requeridos y se necesitan varias etapas de ultrafiltración y purificación.

Los primeros ensayos rápidos usaban látex coloreado para formar la señal visual. El látex era originalmente, y aún es, el principal procedimiento de marcaje usado en ensayos de aglutinación. Esto se debe a su predisposición para aglutinar en presencia de componentes de unión. Para ensayos rápidos, en los que la estabilidad del conjugado es crítica para evitar resultados de falso positivo, esta predisposición para aglutinar puede convertirse en un problema importante.

A finales de los años 80 surgió un uso muy importante de conjugados de oro para su incorporación en inmunoensayos de ensayo rápido. Los ensayos rápidos que usan anticuerpo marcado con oro para visualizar la presencia de un analito en una muestra líquida en membranas revestidas con anticuerpos han evolucionado para ser el ensayo de elección en casos en los que se requieran formatos de ensayo no instrumentales, manuales,

rápidos y económicos. Tales ensayos pueden ponerse en formatos de varillas o como dispositivos encerrados dentro de alojamientos de plástico.

Los procedimientos de ensayo para el diagnóstico de diversas enfermedades están mejorándose constantemente. En la actualidad, los procedimientos inmunológicos están entre los procedimientos más sensibles usados para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras. En tales ensayos, las partículas de oro coloidal se revisten de forma pasiva con anticuerpos específicos para el agente de interés y se secan en una capa de conjugado. Si el antígeno está presente en una muestra de ensayo, se formará un complejo inmune entre el anticuerpo detector marcado con oro coloidal y el antígeno en la muestra de ensayo. El complejo inmune asciende después cromatográficamente por una tira en la que se ha puesto una capa de un anticuerpo de captura, o directamente a través de una membrana revestida con anticuerpo. La presencia de una franja roja visual, debido a las partículas de oro, es indicativa de un ensayo positivo. Puede adaptarse el mismo principio para la detección de anticuerpos específicos si los antígenos homólogos o conjugado de péptido-vehículo se inmovilizan en la tira. Para ciertos analitos (por ejemplo hormonas, drogas recreativas, pesticidas y polisacáridos) que no pueden detectarse fácilmente en este sistema, puede usarse un sistema de inmunocromatografía de flujo lateral de tipo competición.

Aunque puede adsorberse de forma pasiva anticuerpos en el coloide de oro, se ha mostrado que dicho revestimiento directo con frecuencia no tiene éxito debido a la disociación parcial de los anticuerpos y los anticuerpos libres compiten con el conjugado de anticuerpo-oro dando como resultado una baja sensibilidad. Además la orientación incorrecta de los anticuerpos adsorbidos asociados con revestimiento pasivo da como resultado un conjugado que posee baja actividad inmunológica. La adsorción pasiva en coloides de oro se restringe a ligandos cargados positivamente y también a ligandos con un fuerte carácter hidrófobo. Sin embargo los ligandos cargados neutros y pequeños de importancia biológica no pueden unirse directamente a las partículas de oro. Las desventajas descritas anteriormente limitan el uso de sondas de oro en ensayos, tales como ensayos rápidos.

Se han descrito varios procedimientos para potenciar la adsorción de ligandos biológicos a soles de oro. La introducción de grupos sulfihidrilo en la molécula de proteína mediante tiolación es el procedimiento más usado. La modificación del ligando de este modo puede aumentar su capacidad para unirse a soles de oro como se demuestra por el aumento de la resistencia a aglomeración inducida por sales. Sin embargo, dicha modificación está acompañada de pérdida significativa de actividad.

Se han usado modificadores proteicos tales como N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) , 2 iminotiolano (2 IT) o N-Succinimidil 3-[2-piridilditio]-propionamido (SPDP) para tiolación de anticuerpos. Los grupos sulfihidrilo del anticuerpo modificado pueden después unirse fuertemente al sol de oro a través de enlace dativo.

También pueden crearse grupos sulfihidrilo en una molécula de anticuerpo por fragmentación del anticuerpo con pepsina o papaína. Los fragmentos Fab producidos de este modo contienen sulfihidrilo listo para conjugación con soles de oro.

También se ha descrito... [Seguir leyendo]

1. Ensamblaje molecular que comprende un ligando, un engarce y una entidad detectable, en el que el ligando está unido covalentemente al engarce, y el engarce es un agente quelante que forma un complejo de coordinación con la entidad detectable, caracterizado porque la entidad detectable comprende partículas de oro, y porque el agente quelante tiene la estructura química en la que R1, R2, R3, R4 pueden ser iguales o diferentes, en la que R1-R4 se seleccionan del grupo que consiste en -SH, -NH2, -COOH, hidrocarburos C1-C20 que incluyen o se sustituyen con al menos un grupo funcional que comprende al menos un heteroátomo, y n ≥ 1, caracterizado además porque el ligando se selecciona de un grupo de especies químicas que incluye proteínas, péptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, hormonas, antígenos solubles, carbohidratos, polisacáridos, ADN, ARN y lípidos, en los que las partículas de oro tienen cationes divalentes unidos a ellas para mostrar de este modo sitios reactivos para formar un complejo de coordinación con el agente quelante.

2. Ensamblaje molecular de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R1, R2, R3 y/o R4 es un heterociclo.

3. Ensamblaje molecular de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el heterociclo es Nhidroxisuccinimida éster.

4. Ensamblaje molecular de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el heterociclo es maleimida.

5. Un procedimiento para producir un ensamblaje molecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el procedimiento comprende las etapas de:

i) mezclar una alícuota de una solución que comprende un ligando con una alícuota de una solución que comprende un agente quelante activado, uniendo de este modo el ligando covalentemente con el agente quelante, formando de este modo un agente de unión ii) mezclar una alícuota de suspensión de partículas de oro con una alícuota de una solución que comprende cationes divalentes, para formar de este modo sitios reactivos adecuados para formar complejos de coordinación iii) mezclar una alícuota del agente de unión proporcionado en la etapa (i) con una alícuota de las partículas de oro que tienen cationes unidos a ellas producidas en la etapa (ii) formando de este modo el ensamblaje molecular en solución.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el procedimiento comprende además la etapa de bloquear sitios no revestidos en las partículas de oro, para evitar aglomeración de las partículas, a través de la adición de un compuesto adecuado.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el compuesto es albúmina de suero bovino, caseína, polivinil pirrolidona y alcohol polivinílico.

8. Uso de un ensamblaje molecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 como reactivo en un procedimiento para la detección de especies químicas y/o bioquímicas.

9. Uso de un ensamblaje molecular de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la especie química se selecciona de un grupo de especies químicas que incluye proteínas, péptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, hormonas, antígenos solubles, carbohidratos, polisacáridos, ADN, ARN y lípidos.

10. Uso de un ensamblaje molecular de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la especie bioquímica se selecciona de un grupo de especies bioquímicas que incluye células, bacterias y partículas virales.

11. Un kit para la detección de especies químicas y/o bioquímicas, comprendiendo el kit un ensamblaje molecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un dispositivo; comprendiendo el dispositivo un receptáculo para recibir el ensamblaje molecular, un receptáculo para recibir una muestra que comprende las especies para detectar, una zona de migración, y una zona de detección para detectar la interacción entre la especie y el ensamblaje molecular.

12. Un kit para la detección de especies químicas y/o bioquímicas de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la especie química se selecciona de un grupo de especies químicas que incluye proteínas, péptidos, anticuerpos o

fragmentos de anticuerpos, hormonas, antígenos solubles, carbohidratos, polisacáridos, ADN, ARN y lípidos; y en el que la especie bioquímica se selecciona de un grupo de especies bioquímicas que incluye células, bacterias y partículas virales.