Procedimiento para el diagnóstico de una granulomatosis de Wegener.

Procedimiento in vitro para la detección de una granulomatosis de Wegener en un sujeto que comprendedeterminar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anti-células endoteliales (AACE) o anti-célulasmusculares lisas vasculares (CMLV),

que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biológica que procede deun paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina es indicadora de una granulomatosis de Wegener.

Procedimiento para el diagnostico de una granulomatosis de Wegener

La invencion se refiere a un procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener, que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de anticuerpo (Ac) anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas del musculo liso vasculares (CMLV) anti-vinculina, en una muestra biologica procedente de un paciente tal como se define en las reivindicaciones.

Tecnica anterior

Las vasculitis son enfermedades huerfanas, cuya prevalencia es baja, del orden de 24 a 150 por millon de habitantes. Representan un grupo de enfermedades caracterizadas por la presencia de lesiones inflamatorias en las paredes de los vasos. Las vasculitis se clasifican de acuerdo con el tamano de los vasos afectados y responden a diferentes mecanismos patogenos dominantes: una produccion de citocinas proinflamatorias y una activacion de los macrofagos en las vasculitis que afectan a los vasos de gran calibre, tales como la enfermedad de Horton (o arteritis de celulas gigantes) ; el deposito de complejos inmunes circulantes responsables de la activacion de la via clasica del complemento, y el reclutamiento de neutrofilos en las vasculitis que afectan a los vasos de tamano medio, tales como la periarteritis nodosa asociada a una infeccion con el virus de la hepatitis B; y una activacion de los neutrofilos por los Ac anti-citoplasma de polinucleares neutrofilos (ANCA) , preferiblemente en las vasculitis que afectan a vasos de pequeno calibre, tales como la granulomatosis de Wegener y la poliangitis microscopica.

La enfermedad de Horton se caracteriza por cefaleas debidas a la lesion de la arteria temporal, asociadas con un deterioro del estado general, una seudopoliartritis rizomelica en uno de cada dos casos y en la gran mayoria de los casos, un sindrome inflamatorio,

La granulomatosis de Wegener es una vasculitis granulomatosa que afecta principalmente los senos faciales, el pulmon y el rinon, asociada en las formas sistemicas, en el 90% de los casos, a Ac anti-proteinasa 3.

La poliangitis microscopica es una vasculitis necrosante que afecta a los vasos de pequeno calibre y que puede causar un dano glomerular y de los capilares pulmonares responsable de un sindrome neumo-renal, ademas de manifestaciones sistemicas asociadas con la vasculitis.

El sindrome de Churg-Strauss es un asma de aparicion tardia con evolucion grave asociada a hipereosinofilia y vasculitis necrosante.

Actualmente el diagnostico de una vasculitis positiva para ANCA siempre se basa en una biopsia, ya sea una biopsia cutanea, una biopsia renal, una biopsia neuromuscular u otra. Los ANCA constituyen una ayuda importante en el diagnostico de la vasculitis sistemica. Los ANCA anti-mieloperoxidasa (MPO) estan presentes por tanto en el 60 a 75% de los pacientes que padecen poliangitis microscopica y en el 38% de los pacientes que padecen sindrome de Churg-Strauss. En consecuencia, una proporcion significativa de pacientes no tienen ANCA, lo que hace dificil el diagnostico, la evaluacion del pronostico y el tratamiento terapeutico. Hasta la fecha no existe ningun biomarcador identificado durante el curso de la enfermedad de Horton. El diagnostico de la enfermedad de Horton se basa en la mayoria de los casos en una biopsia de la arteria temporal, que es positiva en el 80% de los casos de enfermedad de Horton.

Por lo tanto, existe una necesidad de identificar marcadores inmunologicos de interes para el diagnostico y/o pronostico durante el curso de la enfermedad de Horton y de identificar otros marcadores inmunologicos de interes, diferentes de los ANCA durante el curso de vasculitis positivas para ANCA. El documento de solicitud internacional WO2004/094638, en japones, se refiere a una busqueda de anticuerpos anti-peroxirredoxina 2 en el suero de pacientes que padecen vasculitis, pero parece ser el unico en este campo.

Desde este punto de vista, los inventores se han centrado en anticuerpos (Ac) anti-celulas endoteliales (AACE) , anticuerpos anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) . Especialmente los AACE se detectan y parecen tener un papel clave en la patogenesis de las vasculitis (Guilpain y Mouthon, Clinic Rev. Allerg Immunol, Oct. 2008, 35 (12) :59-65) . Por lo tanto, la fijacion de los AACE a las celulas endoteliales puede conducir a la destruccion de la celula diana por un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de los Ac (ADCC) , puede inducir la apoptosis y aumentar la expresion de las moleculas de adhesion. Sin embargo, hasta ahora no se habian identificado las dianas antigenicas de estos anticuerpos.

Gobel et al., American Journal of Kidney Diseases, 1996, 28 (2) :186-194, se refiere a la presencia de autoanticuerpos anti-celulas endoteliales en el suero de pacientes que padecen granulomatosis de Wegener.

Compendio de la invención Los inventores han identificado ahora dianas antigenicas de los anticuerpos anti-celulas endoteliales (AACE) y de los anticuerpos anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) en las vasculitis, especialmente en la enfermedad de Horton y las vasculitis positivas para ANCA.

Sobre esta base, la invencion proporciona un procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener en un sujeto, que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anticelulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) , que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biologica que procede de un paciente, indicando la presencia del anticuerpo anti-vinculina una granulomatosis de Wegener.

En una realizacion particular, el procedimiento de la invencion para detectar una granulomatosis de Wegener comprende ademas la determinacion de la presencia y/o la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) , estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en FUbp2 (proteina 2 de union al elemento aguas arriba far, del ingles quot;Far upstream element-binding protein 2quot;) , caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, precursor mitocondrial de la proteina de estres-70, lamina-A/C, ribonucleoproteina K nuclear heterogenea, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3, subunidad zeta (theta) de la proteina 1 del complejo T, subunidad beta de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, ribonucleoproteina H nuclear heterogenea, cadena beta de la tubulina, fructosa-bifosfato aldolasa A, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, precursor de calumenina, reticulocalbina-3, subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S, pirofosfatasa inorganica, anexina A5, 14-3-3 proteina epsilon, 6fosfogluconolactonasa, galectina-1, precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacido-coenzima A transferasa 1 y la ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea, en una muestra biologica procedente de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina y dicho al menos otro anticuerpo diferente es indicativa de una granulomatosis de Wegener.

Preferiblemente, la presencia de dicho al menos un anticuerpo en la muestra biologica se compara con un valor testigo, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en una cantidad superior al valor testigo es indicativa de una vasculitis o de un riesgo de desarrollar vasculitis.

Descripción detallada de la invención Los inventores han utilizado celulas endoteliales de venas umbilicales humanas normales (HUVEC) como fuente de antigenos y han sometido a ensayo los sueros de pacientes que tienen la enfermedad de Horton o una vasculitis sistemica asociada a anticuerpos anti-citoplasma de polinucleares neutrofilos (ANCA) y de sujetos sanos.

Para identificar las dianas de los anticuerpos, los inventores han utilizado una inmunotransferencia bidimensional, en donde la identificacion de los antigenos se realizaba por espectrometria de masas.

Los inventores tambien han sometido a ensayo sueros de pacientes que padecen la enfermedad de Horton.

Definiciones:

La expresion quot;muestra biologicaquot; se refiere a cualquier muestra biologica que procede de un paciente. Ejemplos de muestras incluyen liquidos biologicos, biopsias de tejidos. Preferiblemente, la muestra puede ser sangre, suero, saliva, orina, semen. Mas preferiblemente, la muestra biologica es una muestra de sangre o suero.

El termino quot;pacientequot; se refiere a cualquier sujeto susceptible de ser sometido a ensayo. Preferiblemente,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener en un sujeto que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) , que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biologica que procede de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina es indicadora de una granulomatosis de Wegener.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, para la deteccion de una granulomatosis de Wegener que comprende ademas determinar la presencia y/o la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) , estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en FUbp2 (proteina 2 de union al elemento aguas arriba far) , caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, precursor mitocondrial de la proteina de estres-70, lamina-A/C, ribonucleoproteina K nuclear heterogenea, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3, subunidad zeta de la proteina 1 del complejo T, subunidad beta de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, ribonucleoproteina H nuclear heterogenea, cadena beta de la tubulina, fructosabifosfato aldolasa A, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, precursor de calumenina, reticulocalbina-3, subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S, pirofosfatasa inorganica, anexina A5, 14-3-3 proteina epsilon, 6-fosfogluconolactonasa, galectina-1, precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacidocoenzima A transferasa 1 y ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea, en una muestra biologica procedente de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina y dicho al menos otro anticuerpo es indicativa de una granulomatosis de Wegener.

3. Procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas la determinacion de la presencia y/o de la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) , estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3 y precursor de calumenina.

4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra biologica es una muestra de sangre o de suero.

5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en la muestra biologica se compara con un valor testigo, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en una cantidad superior al valor testigo es indicadora de una granulomatosis de Wegener.

6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cantidad de dicho al menos un anticuerpo se determina por un inmunoensayo.

7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en donde el inmunoensayo es una prueba de ELISA.

8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el paciente es un ser humano.

9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paciente no tiene anticuerpos ANCA.