Dispositivos, sistemas y métodos accionadores de gotitas.

Un método de preparación de una muestra para análisis, el método comprende:

(a) proporcionar un accionador de gotitas (4700) que comprende:

(i) un sustrato de operaciones con gotitas (4710);

(ii) electrodos (4720) dispuestos para llevar a cabo operaciones con gotitas en una superficie de operacionescon gotitas del sustrato de operaciones con gotitas (4710);

(iii) un sustrato superior (4714) que es una cubierta adyacente a la superficie de operaciones con gotitas yseparada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas(4716) entre la superficie de operaciones con gotitas y la cubierta;

(iv) un reservorio (4730) asociado con el sustrato superior (4714) y que contiene perlas magnéticamentesensibles (4734) que tienen una afinidad por uno o más analitos diana (4754) y/o sustancias que comprendenuno o más analitos diana (4754);

(v) una ruta de líquido que se extiende desde el reservorio (4730) en el espacio de operaciones con gotitas(4716);

(vi) una fuente de campo magnético (4740) asociada con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) yconfigurada para producir un campo magnético suficiente para atraer las perlas magnéticamente sensibles(4734);

(b) suministrar un fluido de muestra (4752) en el reservorio, la muestra comprende potencialmente uno o más delos analitos y/o sustancias diana (4754);

(c) hacer fluir el fluido de muestra (4752) que comprende las perlas magnéticas (4734) a través de la ruta delíquido en el espacio de operaciones con gotitas (4716);

(d) agregar las perlas magnéticas (4734) en la fuente de campo magnético (4740);

(e) retirar el campo magnético o retirar las perlas (4734) del campo magnético para dar una gotita en el espaciode operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734).

Dispositivos, sistemas y métodos accionadores de gotitas 1 Solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica prioridad para las solicitudes de patente de EE.UU. siguientes: 61/108.880, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 28 de octubre de 2008; 61/115.654, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de noviembre de 2008; 61/153.598, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de febrero de 2009; 61/052.885, titulada "Reducing Droplet Cross-contamination in a Droplet Actuator", presentada el 13 de mayo de 2008; 61/098.860, titulada "Reducing Droplet Cross-contamination in a Droplet Actuator", presentada el 22 de septiembre de 2008; 61/160.607, titulada "Reducing Droplet Crosscontamination in a Droplet Actuator", presentada el 16 de marzo de 2009; 61/103.332, titulada "Nucleic Acid Handling on a Droplet Actuator", presentada el 7 de octubre de 2008; 61/141.820, titulada "Sample Preparation and Assay Execution on a Droplet Actuator", presentada el 31 de diciembre de 2008.

Interés gubernamental

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo AI065169-01 y AI066590-02 concedido por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

La declaración anterior con respecto al apoyo del gobierno bajo AI065169-01 se aplica solamente a aquellos aspectos de la invención descritos y reivindicados en la presente solicitud que surjan de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 61/108.880, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 28 de octubre de 2008; 61/115.654, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de noviembre de 2008; 61/153.598, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de febrero de 2009; y con respecto al apoyo del gobierno bajo AI066590-02 se aplica solamente a aquellos aspectos de la invención descritos y reivindicados en la presente solicitud que surjan de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 61/103.332, titulada "Nucleic Acid Handling on a Droplet Actuator", presentada el 7 de octubre de 2008; 61/141.820, titulada "Sample Preparation and Assay Execution on a Droplet Actuator", presentada el 31 de diciembre de 2008.

3. Antecedentes Los accionadores de gotitas se usan para llevar a cabo una gran variedad de operaciones con gotitas. Un accionador de gotitas incluye por regla general dos sustratos separados por un espacio de operaciones con gotitas. Los sustratos incluyen electrodos para llevar a cabo operaciones con gotitas. El espacio de operaciones con gotitas entre los sustratos se rellena generalmente con un fluido de carga líquido que es inmiscible con el fluido que se somete a las operaciones con gotitas. Las operaciones con gotitas se controlan mediante electrodos asociados con uno o ambos sustratos. Los componentes de las gotitas pueden en algunos casos salir de las gotitas hacia el fluido de carga. Desde el fluido de carga, dichos componentes pueden contaminar otras gotitas. La invención se refiere a ciertas técnicas novedosas para reducir o eliminar el movimiento de contaminantes desde una gotita a otra en un accionador de gotitas a través del fluido de carga líquido. En una aplicación, los accionadores de gotitas se usan para llevar a cabo análisis genéticos usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Existe la necesidad de métodos mejorados de realización de PCR en un accionador de gotitas que proporcionen amplificación y detección óptimas de una muestra diana.

4. Breve descripción de la invención La invención proporciona un método para amplificar y/o detectar un ácido nucleico diana en una muestra. El método puede incluir proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Cada gotita puede incluir una parte de la muestra. El método puede incluir tratar dos o más subconjuntos de gotitas de la reacción de amplificación bajo condiciones de amplificación del ácido nucleico diana para proporcionar los correspondientes subconjuntos de gotitas amplificadas con el ácido nucleico amplificado. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación puede incluir una o más de las gotitas de reacción de amplificación. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación se puede tratar bajo diferentes condiciones para amplificar el ácido nucleico diana. El método puede incluir preparar las gotitas amplificadas para detección. El método puede incluir detectar una señal procedente de las gotitas amplificadas. El método puede incluir también determinar la cantidad y/o la identidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra. Proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir dispensar el conjunto de gotitas de amplificación del ácido nucleico desde una gotita de muestra. La gotita de muestra se puede proporcionar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas, y la dispensación puede ser mediada por un electrodo. La gotita de muestra se puede proporcionar en un reservorio de un accionador de gotitas. El accionador de gotitas puede incluir una ruta del líquido desde el reservorio hasta el espacio de operaciones con gotitas. La dispensación del conjunto de gotitas de amplificación del ácido nucleico puede incluir hacer fluir la gotitas de muestra a través de la ruta de líquido hacia el espacio de operaciones con gotitas, y usar electrodos para dispensar las gotitas de la reacción de amplificación en el espacio de operaciones con gotitas. Proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir proporcionar una gotita de muestra; dividir la gotita de muestra en múltiples subgotitas de muestra, y combinar cada una de las subgotitas de muestra con una o más gotitas puede incluir reactivos de amplificación para proporcionar las gotitas de la reacción de amplificación. Una o varias de las etapas de los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas que usa operaciones con gotitas mediadas por electrodos. Una o varias de las etapas de los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar usando operaciones con gotitas mediadas por electrodos. La gotita de muestra, las múltiples subgotitas y la una o varias gotitas pueden incluir reactivos de amplificación. Las gotitas de la reacción de amplificación se pueden colocar en el espacio de operaciones con gotitas, y se pueden rodear al menos parcialmente por un fluido de carga líquido. Proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir: proporcionar una gotita de muestra; combinar la gotita de muestra con uno o varias gotitas puede incluir reactivos de amplificación para proporcionar una gotita preparada para la amplificación; y dividir la gotita preparada para la amplificación para proporcionar las gotitas de la reacción de amplificación. La gotita de muestra, las una o varias gotitas pueden incluir reactivos de amplificación, la gotita de la reacción de amplificación precursora, y las gotitas de la reacción de amplificación se pueden colocar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas; y rodearse al menos parcialmente con un fluido de carga líquido. El método puede incluir tratar la gotita preparada para la amplificación bajo condiciones seleccionadas para proporcionar suficiente ácido nucleico amplificado en la gotita preparada para la amplificación para asegurar que cada gotita de la reacción de amplificación incluirá ácido nucleico diana si el ácido nucleico diana puede estar presente en la muestra. Tratar la gotita preparada para la amplificación puede incluir ciclado térmico de la gotita preparada para la amplificación durante 1-50 ciclos, 1-40 ciclos, 1-30 ciclos, 1-20 ciclos, o 1-10 ciclos, o 1-5 ciclos. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir ciclar las gotitas de la reacción de amplificación entre dos o más zonas térmicas transportando las gotitas a lo largo de una pluralidad de rutas de electrodos en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir ciclar subconjuntos de dos o más de las gotitas de la reacción de amplificación entre dos o más zonas térmicas transportando gotitas en cada subconjunto a lo largo de una ruta de electrodos común en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de una muestra para análisis, el método comprende:

(a) proporcionar un accionador de gotitas (4700) que comprende:

(i) un sustrato de operaciones con gotitas (4710) ;

(ii) electrodos (4720) dispuestos para llevar a cabo operaciones con gotitas en una superficie de operaciones con gotitas del sustrato de operaciones con gotitas (4710) ;

(iii) un sustrato superior (4714) que es una cubierta adyacente a la superficie de operaciones con gotitas y separada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas (4716) entre la superficie de operaciones con gotitas y la cubierta;

(iv) un reservorio (4730) asociado con el sustrato superior (4714) y que contiene perlas magnéticamente sensibles (4734) que tienen una afinidad por uno o más analitos diana (4754) y/o sustancias que comprenden uno o más analitos diana (4754) ;

(v) una ruta de líquido que se extiende desde el reservorio (4730) en el espacio de operaciones con gotitas (4716) ;

(vi) una fuente de campo magnético (4740) asociada con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) y configurada para producir un campo magnético suficiente para atraer las perlas magnéticamente sensibles (4734) ;

(b) suministrar un fluido de muestra (4752) en el reservorio, la muestra comprende potencialmente uno o más de los analitos y/o sustancias diana (4754) ;

(c) hacer fluir el fluido de muestra (4752) que comprende las perlas magnéticas (4734) a través de la ruta de líquido en el espacio de operaciones con gotitas (4716) ;

(d) agregar las perlas magnéticas (4734) en la fuente de campo magnético (4740) ;

(e) retirar el campo magnético o retirar las perlas (4734) del campo magnético para dar una gotita en el espacio de operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734) .

2. El método de la reivindicación 1, en el que el accionador de gotitas comprende un electrodo reservorio (4718) asociado con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) y dispuesto para recibir el fluido que entra en el espacio de operaciones con gotitas (4716) a través de la ruta de líquido, y en el que la fuente del campo magnético (4740) se coloca en un lado opuesto del electrodo reservorio (4718) con respecto a la ruta de líquido.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el accionador de gotitas comprende un aparato de ultrasonidos (4742) dispuesto para aplicar energía sónica a un fluido de muestra (4752) en el reservorio (4730) y que comprende además sonicar la muestra (4752) en el reservorio (4730) .

4. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) los analitos y/o sustancias comprenden uno o más analitos diana comprenden una célula por la que las perlas (4734) tienen afinidad;

(b) el método comprende además combinar la gotita de muestra en el espacio de operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734) producidas mediante la etapa 1 (e) con una gotita de lisis (4756) que comprende un reactivo de lisis celular; y

que comprende además volver a aplicar el campo magnético para inmovilizar las perlas magnéticas (4734) .

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además transportar una gotita (4758) lejos de las perlas magnéticas (4734) .

6. El método de la reivindicación 4, que comprende además transportar un porción (4758) de la gotita de muestra lejos de las perlas magnéticas (4734) .

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que comprende además combinar la gotita o porción de la gotita de muestra (4758) transportada lejos con una gotita (4762) que comprende perlas (4764) que tienen afinidad por el uno o más analitos diana.

8. El método de la reivindicación 7, que comprende además realizar un protocolo de lavado para lavar las perlas (4764) que tienen afinidad por el uno o más analitos diana lo que produce una gotita que comprende perlas (4764) que comprende analito diana sustancialmente purificado.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además realizar un protocolo de análisis que utiliza la gotita que5 comprende las perlas (4764) que comprende el analito diana sustancialmente purificado.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la realización de una etapa del protocolo de análisis se lleva a cabo en el espacio de operaciones con gotitas (4716) .

11. El método de la reivindicación 9, en el que la gotita que comprende perlas (4764) que comprende el analito diana

sustancialmente purificado se retira del espacio de operaciones con gotitas (4716) antes de realizar el protocolo de 10 análisis.

12. El método de la reivindicación 9, que comprende además proporcionar una salida indicativa de los resultados del protocolo de análisis.

13. El método de la reivindicación 8, que comprende además retirar la gotita (4762) que comprende perlas (4764) que comprende analito diana sustancialmente purificado del espacio de operaciones con gotitas (4716) .

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Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

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Figura 10

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Figura 12A

Figura 12B

Figura 13

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Figura 20

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Figura 22

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Figura 27

Figura 28

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Figura 30

Figura 31

Figura 32

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Figura 40

Figura 41

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Figura 45

Figura 47A

Figura 47B

Figura 47C

Figura 47D

Figura 47E

Figura 47F

Figura 47G

Figura 47H

Figura 47I

Figura 48A

Figura 48B