Dispositivo y método para la detección de tiras reactivas de orina comprometidas por la humedad.

Método de detección de reactivos sensibles a la humedad, comprometidos por la humedad,

poniéndose dichos reactivos en contacto con una muestra que contiene agua y detectándose la presencia de un analito en la muestra mediante su reacción con dichos reactivos sensibles a la humedad, comprendiendo el método:

(a) medir la reflectancia de la luz a la longitud de onda de los productos de dicha reacción de dichos reactivos sensibles a la humedad con dicho analito en dos momentos predeterminados tras poner en contacto dichos reactivos con dicha muestra;

(b) medir en los mismos dos momentos predeterminados la reflectancia de la luz a la longitud de onda de un colorante de referencia infrarrojo, combinándose dicho colorante con dichos reactivos sensibles a la humedad y teniendo una longitud de onda característica separada de la longitud de onda medida en (a) en al menos 120 nm;

(c) calcular la razón de las longitudes de onda medidas en (a) y (b) y concluir que los reactivos tienen una actividad inferior a la esperada a partir del cambio en dicha razón entre dichos dos momentos predeterminados.

Dispositivo y método para la detección de tiras reactivas de orina comprometidas por la humedad

Antecedentes de la invención Esta invención se refiere de manera general a mejorar el rendimiento y la fiabilidad de tiras reactivas que emplean reactivos sensibles a la humedad, particularmente las usadas para determinar la presencia de analitos en muestras de orina, tales como albúmina, proteína, creatinina, nitrato, uristatina, esterasa leucocitaria (glóbulos blancos) , hemoglobina (glóbulos rojos) , cetonas, glucosa, bilirrubina, urobilógeno y otros que resultan familiares para los expertos en la técnica. Las mediciones de proteasas e inhibidores de proteasas tales como esterasa leucocitaria (elastasa humana) o inhibidor de tripsina urinaria (bikunina, uristatina) son especialmente importantes porque pueden indicar infecciones del riñón o del aparato genitourinario. Estas proteasas y tiras de inhibidores de proteasas se basan en la hidrólisis de sustratos proteolíticos por proteasas para generar señales detectables. Dado que las reacciones bioquímicas requieren agua para que se produzca la hidrólisis enzimática, tienden a ser sensibles a la humedad y pueden interferir con las señales detectables mediante reacciones de fondo.

La patente estadounidense 5.663.044 describe la técnica anterior en el campo de la detección de leucocitos, esterasas o proteasas y para enseñar de manera general el uso de una composición que incluye una sal de diazonio, uno de un grupo de ésteres propensos a hidrólisis en presencia de leucocitos, esterasas o proteasas y un metal alcalinotérreo. La patente ‘044 enseña la medición de la reflectancia de la luz a aproximadamente 570 nm para determinar la cantidad de leucocitos en la muestra de orina. Se compara la reflectancia a 570 nm con una medida de patrón de la reflectancia a 690 nm. La patente indica que la presencia de metal alcalinotérreo fomenta la estabilidad de la sal de diazonio. También sugiere que el metal alcalinotérreo absorbe humedad que puede provocar un cambio de color de fondo. La experiencia ha mostrado que este sistema de reactivos es sensible a la humedad y que las tiras reactivas deben mantenerse en un entorno oscuro antes de su uso. El contenido en humedad de las tiras reactivas debe mantenerse por debajo del 2% en peso para evitar que se degrade el rendimiento. Sin embargo, la medición de humedad en las tiras reactivas no es muy precisa. Existe una necesidad particular de medir el contenido en humedad de manera muy precisa para garantizar que las tiras reactivas son estables en un recipiente seco cerrado a lo largo de varios años.

Otro ejemplo del uso de reactivos sensibles a la humedad se comenta en las patentes estadounidenses 6.770.764;

6.955.921 y 7.001.737. En las reacciones descritas, la presencia de inhibidores de tripsina urinaria en una muestra de orina se detecta añadiendo una muestra a tiras reactivas que contienen una cantidad conocida de tripsina, un sustrato de tripsina, es decir ésteres de arginina hidrolizados por tripsina para producir un alcohol, y una sal de diazonio. Cuando están presentes inhibidores de tripsina, inhiben la reacción entre tripsina y el sustrato. Esto reduce el color producido por la sal de diazonio a partir de su reacción con el fenol producido cuando el sustrato de tripsina reacciona con la cantidad conocida de tripsina. Midiendo el color producido, puede determinarse la presencia de inhibidores de tripsina.

En la patente estadounidense 6.316.264 se añade un colorante infrarrojo (IR) en una ubicación predeterminada sobre tiras con reactivos con el fin de garantizar que las tiras están apropiadamente alineadas en el instrumento usado para detectar y/o medir la presencia de analitos en una muestra aplicada a la tira. El rango IR para los colorantes era en general de entre 700 y 2500 nm, pero se decía que se preferían colorantes que tienen una fuerte absorbancia en el intervalo de 825-855 nm, siendo la absorbancia en el rango visible (400-700 nm) inferior al 20%.

Tal como se sugirió anteriormente, sería ventajoso si las tiras reactivas de orina que se ven comprometidas por la humedad pudieran identificarse con una precisión mejorada para evitar un uso no seguro y para corregir los resultados afectados por la humedad. Dado que los reactivos que implican hidrólisis de sustratos proteolíticos son especialmente sensibles a la humedad, si pueden usarse los propios reactivos para indicar la presencia de humedad no deseada se habrá obtenido una mejora significativa. La presente invención proporciona un método de este tipo, que se comentará en detalle a continuación.

Sumario de la invención La invención tiene aplicación para tiras reactivas sensibles a la humedad que se usan para medir la hidrólisis de sustratos proteolíticos usados para detectar proteasas o inhibidores de proteasas. Se encuentra un ejemplo en la detección de leucocitos, esterasas o proteasas, tal como se describe en la patente estadounidense 5.663.044. Se encuentra otro ejemplo en la detección de inhibidores de tripsina urinaria descrita en las patentes estadounidenses 6.770.764; 6.955.921 y 7.001.737.

En general, la invención es un método de detección de humedad excesiva en tiras reactivas que emplean reactivos sensibles a la humedad. Midiendo el color u otra respuesta desarrollada por reactivos sensibles a la humedad justo después de aplicar una muestra y comparando el resultado con un colorante de referencia infrarrojo conocido, se identifican reactivos comprometidos por la humedad y entonces puede marcarse o descartarse el resultado.

Cuando se mide el color desarrollado mediante reflectancia de la luz, se compara el valor de la razón de reflectancia (es decir la razón de la reflectancia de los reactivos con respecto a la reflectancia del colorante de referencia) inmediatamente después de aplicar una muestra con el valor de la razón de reflectancia tomada poco tiempo después y se usa para determinar el efecto de humedad excesiva y para rechazar los reactivos si están comprometidos por la humedad. Puede medirse una segunda razón de reflectancia para determinar si la muestra tiene un color no habitual y puede estar afectando a los resultados.

En una realización preferida, para detectar reactivos leucocitarios comprometidos por la humedad, los reactivos incluyen una sal de diazonio, por ejemplo DNSA (ácido 1-diazo-2-naftol-4-sulfónico) , que reacciona con un éster hidrolizable, por ejemplo PPTA (éster de 2-hidroxi-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina) . Cuando está presente esterasa leucocitaria en la muestra de orina, se produce un color en proporción a la cantidad de leucocitos presentes. En esta realización, se compara la reflectancia a una longitud de onda de luz de 520-570 nm con la reflectancia de aproximadamente 825 nm característica del colorante de referencia.

Breve descripción de los dibujos La única figura es un diagrama de flujo o bien para determinar el contenido en leucocitos de una muestra o bien para rechazar el resultado por estar comprometido por la humedad.

Descripción de realizaciones preferidas La invención incluye un método mejorado de medición de la hidrólisis de sustratos proteolíticos en muestras de orina aplicadas a tiras reactivas. En general, pueden usarse reactivos basados en sustratos proteolíticos para detectar cualquier proteasa. Se hace corresponder la secuencia de aminoácidos de los reactivos con el tipo preferido por la proteasa que está detectándose y se fija la secuencia de aminoácidos a un resto generador de señal que tras la hidrólisis forma la señal. Un ejemplo de este principio es la detección de esterasa leucocitaria, que se usa para detectar la presencia de leucocitos en una muestra, tal como se describe en la patente estadounidense 5.663.044. La presencia de leucocitos se correlaciona con la reflectancia de la luz a la longitud de onda característica de los reactivos con referencia a la reflectancia de la luz a una longitud de onda característica de un colorante de referencia infrarrojo. La comparación de la reflectancia medida se correlaciona con la presencia de leucocitos tras un tiempo de incubación de aproximadamente 20 segundos a 3 minutos tras la aplicación de una muestra de orina a los reactivos. Tales tiras reactivas pueden verse comprometidas por una humedad excesiva, lo que puede reducir la actividad de los reactivos y mostrar de manera falsa desarrollo de color indicativo de la presencia de leucocitos en una muestra de orina. Midiendo la razón de reflectancia a partir de los reactivos con respecto al colorante de referencia infrarrojo durante el primer minuto tras haberse aplicado una muestra de orina a los reactivos, el método de la invención determina si los reactivos se han visto comprometidos por una humedad excesiva.... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de reactivos sensibles a la humedad, comprometidos por la humedad, poniéndose dichos reactivos en contacto con una muestra que contiene agua y detectándose la presencia de un analito en la muestra mediante su reacción con dichos reactivos sensibles a la humedad, comprendiendo el método:

(a) medir la reflectancia de la luz a la longitud de onda de los productos de dicha reacción de dichos reactivos sensibles a la humedad con dicho analito en dos momentos predeterminados tras poner en contacto dichos reactivos con dicha muestra;

(b) medir en los mismos dos momentos predeterminados la reflectancia de la luz a la longitud de onda de un colorante de referencia infrarrojo, combinándose dicho colorante con dichos reactivos sensibles a la humedad y teniendo una longitud de onda característica separada de la longitud de onda medida en (a) en al menos 120 nm;

(c) calcular la razón de las longitudes de onda medidas en (a) y (b) y concluir que los reactivos tienen una actividad inferior a la esperada a partir del cambio en dicha razón entre dichos dos momentos predeterminados.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se usa la razón de longitudes de onda medidas en (a) y (b) en el primero de dichos dos momentos predeterminados para indicar reactivos sensibles a la humedad, posiblemente comprometidos por la humedad.

3. Método según la reivindicación 2, en el que se usan en combinación la razón de longitudes de onda medidas en el primero de dichos dos momentos predeterminados y el cambio en la razón entre el primer y el segundo momento predeterminado para determinar si los reactivos sensibles a la humedad están comprometidos por la humedad.

4. Método según la reivindicación 3, que comprende además la etapa de medir la reflectancia de la luz a dos longitudes de onda predeterminadas para indicar la posibilidad de interferencia del color de la muestra con los resultados determinados.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dichos reactivos sensibles a la humedad se basan en sustratos proteolíticos usados para detectar enzimas proteasas.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dichos reactivos sensibles a la humedad se basan en sustratos proteolíticos usados para detectar inhibidores de proteasas.

7. Método según la reivindicación 5, en el que dicha muestra es orina y dicho analito es leucocitos.

8. Método según la reivindicación 6, en el que la muestra es orina y dicho analito es inhibidores de tripsina urinaria.

9. Método según la reivindicación 7, en el que dichos reactivos sensibles a la humedad incluyen una sal de diazonio y un éster propenso a hidrólisis en presencia de leucocitos.

10. Método según la reivindicación 1, que comprende además rechazar reactivos sensibles a la humedad, comprometidos por la humedad.

11. Método de medición de leucocitos en muestras de orina con tiras reactivas, conteniendo dichas tiras reactivas reactivos que incluyen una sal de diazonio y un éster propenso a hidrólisis en presencia de leucocitos, calculando dicho método la cantidad de leucocitos en una muestra de orina en función de la reflexión de la luz a una longitud de onda característica del producto de reacción de dicha sal de diazonio con éster hidrolizado y con referencia a la reflexión de la luz a una longitud de onda de referencia preseleccionada, midiéndose dicha luz reflejada aproximadamente de 1 a 3 minutos tras aplicar una muestra de orina a dichos reactivos, caracterizado porque comprende detectar reactivos comprometidos por la humedad mediante:

(a) añadir un colorante de referencia infrarrojo a dichas tiras reactivas, teniendo dicho colorante de referencia una longitud de onda de reflectancia característica separada de la longitud de onda característica de dicho producto de reacción en al menos 120 nm;

(b) medir la reflectancia de la luz a la longitud de onda de dicho producto de reacción y la longitud de onda característica del colorante de referencia a aproximadamente 20 segundos y aproximadamente 60 segundos tras aplicar dicha muestra de orina a dichos reactivos;

(c) calcular la razón de la reflectancia medida a la longitud de onda de dicho producto de reacción con respecto a la longitud de onda medida de dicho colorante de referencia determinada en (b) para cada uno de dichos momentos a los 20 y 60 segundos y denominar dichas razones L20 y L60;

(d) cuando L20 - L60 es inferior a un primer valor predeterminado y L20 está por debajo de un segundo valor predeterminado, concluir que el sustrato que contiene composición se vio comprometido por la humedad;

(e) medir la reflectancia de la luz a longitudes de onda de aproximadamente 470 y aproximadamente 625 nm y calcular la razón 470/625 nm;

(f) si la razón de 470/625 nm está por encima de un tercer valor predeterminado, concluir que la muestra de orina no tiene color suficiente para afectar a la conclusión alcanzada en la etapa (d) ; y

(g) rechazar el valor calculado para la concentración de leucocitos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la reflectancia de la luz de dicho producto de reacción es a aproximadament.

52. 570 nm.

13. Método según la reivindicación 11, en el que la reflectancia de la luz de dicho colorante de referencia es a aproximadamente 825 nm.

14. Método según la reivindicación 11, en el que la razón de dicho colorante de referencia con respecto a dicho éster hidrolizable es superior a aproximadamente el 0, 5%, reduciendo así la interferencia de fondo del color de dicha muestra y dicha tira reactiva.

15. Método según la reivindicación 11, en el que dicho colorante de referencia se selecciona del grupo que consiste en compuestos de ftalocianina y naftalocianina, colorantes de complejos de metales, colorantes de polimetino, colorantes de di y trifenilmetano, colorantes de quinina, colorantes azoicos, colorantes de transferencia de carga y colorantes de resonancia de carga.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho colorante de referencia es DTO 141.

17. Método según la reivindicación 11, en el que dicho éster hidrolizable es PPTA y dicha sal de diazonio es DSNA.

18. Método según la reivindicación 11, en el que se multiplica L20 - L60 por 1000 y, en el que dicho primer valor predeterminado es 50.

19. Método según la reivindicación 11, en el que se multiplica L20 por 1000 y, en el que dicho segundo valor predeterminado es 700.

20. Método según la reivindicación 11, en el que se multiplica la razón de 470/625 nm por 1000 y, en el que dicho tercer valor predeterminado es 600.

21. Método según la reivindicación 11, en el que se combina dicho colorante de referencia con dichos reactivos.

22. Método según la reivindicación 11, en el que dicho colorante de referencia se ubica separado de dichos reactivos.