Diagnóstico molecular y clasificación de melanoma maligno.

Un método in vitro para diagnosticar melanoma en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con reactivos que se unen específicamente a unpanel de marcadores seleccionados que comprende: (i) los polipéptidos ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, yWNT2, o (ii) los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, en el que existe al menos un reactivo que se unecon cada marcador; y

(b) determinar si cada uno de los marcadores seleccionados se sobreexpresa o subexpresa o no en lamuestra; proporcionando de este modo un diagnóstico para melanoma en el sujeto.

Diagnóstico molecular y clasificación de melanoma maligno.

Antecedentes de la invención El melanoma es la quinta neoplasia más común en los Estados Unidos, cuya incidencia está creciendo más rápidamente que cualquier otra forma de cáncer. Actualmente aproximadamente uno de cada setenta americanos se espera que desarrolle melanoma durante su vida. El melanoma es un tumor maligno de melanocitos (células pigmentarias) . Aunque la mayoría de los melanomas surgen en la piel, este cáncer también puede surgir en superficies mucosas o en otros sitios a los cuales migran las células de la cresta neural. Los melanomas que no se han propagado más allá de su sitio de origen son muy curables ya que estas formas tempranas son lesiones delgadas que no han invadido más allá de la dermis papilar. El tratamiento de dichos melanomas localizados en fase temprana es escisión quirúrgica con márgenes proporcionales a la microfase de la lesión primaria. Algunos melanomas que se han propagado a ganglios linfáticos regionales pueden ser curables con escisión amplia del tumor primario y eliminación de los ganglios linfáticos regionales implicados. En contraste, las formas más avanzadas de melanoma presentan un elevado riesgo de mortalidad por metástasis. Cuando sucede metástasis, las células cancerosas pueden propagarse mediante los ganglios linfáticos hasta sitios distantes tales como el hígado, los pulmones, o el cerebro. El pronóstico para pacientes en las fases más tardías de esta enfermedad es malo con una supervivencia promedio de seis a diez meses.

La capacidad de curar las formas tempranas de melanoma acoplado con su rápida conversión en una forma metastásica incurable pone de relieve la necesidad de métodos de diagnóstico más precisos tanto para la detección temprana de esta enfermedad como para mejores marcadores que sirvan como pronosticadores del progreso de la enfermedad para producir estrategias de tratamiento médico mejor informadas. Lo que compone el problema de idear estrategias terapéuticas apropiadas basadas en diagnóstico y pronóstico precisos es el hecho de que los médicos han descubierto que el melanoma frecuentemente muestra un comportamiento clínico impredecible. Por ejemplo, aunque el grosor vertical del tumor primario es uno de los factores de pronóstico más importante que determina la supervivencia, muchos pacientes con melanomas gruesos no tienen metástasis mientras que un pequeño subconjunto de pacientes con tumores delgados mueren de su enfermedad. Por lo tanto se requieren marcadores mejorados para mejorar los algoritmos de pronóstico para pacientes de melanoma recién diagnosticado. Aunque se han estudiado extensivamente, no se usan rutinariamente factores moleculares en el diagnóstico y la evaluación del pronóstico de pacientes con melanoma. Dichos biomarcadores proporcionarían nuevas vías para la detección de melanoma temprano y constituirían dianas para la evaluación del riesgo de melanoma, así como dianas para el desarrollo de nuevos fármacos. Los métodos y composiciones de esta invención proporcionan estas herramientas adicionales para el cuidado de pacientes con melanoma.

Breve sumario de la invención Generalmente, los métodos de esta invención hallan uso particular en el diagnóstico de melanoma detectando los marcadores NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPP1) , ARPC2, RGS1 y fibronectina 1 (FN1) , que se expresan de forma diferencial (regulados negativa o positivamente) en células de melanoma. Estos marcadores por tanto pueden usarse de forma diagnóstica para distinguir melanoma de nevos benignos. Los marcadores se usan en combinación. ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, y WNT2 se usan en un ensayo de diagnóstico de seis marcadores para melanoma.

Se proporcionan kits de diagnóstico que comprenden reactivos para detectar los marcadores.

En una primera realización, esta invención proporciona un método in vitro para diagnosticar melanoma en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con reactivos que se unan específicamente a un panel de marcadores seleccionados que comprenden: (i) los polipéptidos ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, y WNT2, o (ii) los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, donde hay al menos un reactivo que se une a cada marcador; y

(b) determinar si cada uno de los marcadores seleccionados se sobreexpresa o subexpresa o no en la muestra; proporcionando de este modo un diagnóstico para melanoma en el sujeto.

En un aspecto de esta realización, el reactivo puede ser un anticuerpo, que puede ser monoclonal. En otro aspecto de esta realización, el reactivo puede ser un ácido nucleico, incluyendo un oligonucleótido o serie de cebadores de RT PCR. En otros aspectos de esta realización, el melanoma es melanoma primario o melanoma metastásico y la muestra puede ser una biopsia de piel. En aspectos adicionales de esta realización, el diagnóstico distingue entre nevos benignos frente a melanoma maligno. En algunos formatos, la etapa de determinación puede realizarse usando un inmunoensayo enzimático, tal como un ensayo ELISA o inmunohistoquímico. En otros formatos, la etapa de determinación puede realizarse usando FISH o CGH.

En una segunda realización, la presente invención proporciona un kit para su uso en el diagnóstico de melanoma en un sujeto, comprendiendo el kit reactivos que se unen específicamente a un panel de marcadores seleccionados que comprenden: (i) los polipéptidos ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, y WNT2, o (ii) los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. El kit puede contener adicionalmente reactivos adicionales para realizar la detección usando un inmunoensayo enzimático, tal como un ensayo ELISA o inmunohistoquímico. En otros formatos, el kit puede contener adicionalmente reactivos adicionales para realizar la detección usando FISH o CGH.

Breve descripción de los dibujos Figura 1: Fotomicrografías de melanoma primario que demuestran inmunotinción ausente (panel A) e intenso (panel B) de NCOA3.

Figura 2: Análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de recidiva (RFS) (panel A) y supervivencia específica de enfermedad (DSS) (panel B) de acuerdo con el nivel de expresión de NCOA3.

Figura 3: Panel superior. Inmunotinción de NCOA3 en un melanoma desmoplásico. Obsérvese tinción marrón de células ahusadas. Panel inferior. Inmunotinción de NCOA3 en la metástasis de ganglio linfático del mismo paciente. Obsérvese tinción difusa de células tumorales en el centro.

Figura 4: Actividad anti-metastásica de ribozimas (Rz) y ARNip dirigido contra NCOA3 murino. Se inyectaron células de melanoma B16-F10 por vía intravenosa en grupos de 10 ratones C57B1/6. En los días 3 y 10 después de la inyección, se inyectaron por vía intravenosa complejos de lípido catiónico:ADN que codifican secuencias de vector de control o dos ribozimas y ARNip dirigidos contra diferentes sitios del ARN murino de NCOA3. Los ratones se sacrificaron en el día 25 y se analizaron para la cantidad de tumores pulmonares metastásicos. Las cuatro construcciones mostraron reducciones significativas en la carga tumoral metastásica en comparación con el vector de control (4613) solo (P < 0, 05) .

Figura 5: Pesos de los pulmones de ratones que albergan tumores tratados con diversos anti-NCOA3 o construcciones de control. Los detalles experimentales son idénticos a los descritos en la Figura 4.

Figura 6: Actividad anti-metastásica de ribozima 397 (Rz) dirigida contra NCOA3 contra cáncer mamario murino. Se inyectaron células de carcinoma mamario 4T1 por vía intravenosa en grupos de 10 ratones BALB/c. En los días 3 y 10 después de la inyección, se inyectaron por vía intravenosa complejos de lípido catiónico:ADN que codifican secuencias de vector de control, Rz397, ARNip385, y controles mutantes que contienen una mutación de una única base en la ribozima (m-Rz397) o ARNip (m-ARNip385) . Los ratones se sacrificaron el día 25 y se analizaron para la cantidad de tumores pulmonares metastásicos. Los ratones tratados con Rz397 tuvieron significativamente menos tumores pulmonares que ratones tratados con ARNip385, m-Rz397, o con el vector de control solo.

Figura 7: El direccionamiento a NCOA3 suprime la invasión de células tumorales in vitro. Se transfectaron células B16 con vector solamente, o vector que expresa Rzs397 o ARNip385 dirigido contra NCOA3 murino, y se determinó la invasión usando un ensayo con cámara de Boy den 24 horas después de la transfección.

Figura 8: Fotomicrografías de baja energía (40x, panel A) y alta energía (100x, panel B) de inmunotinción con Wnt-2 en un nevo melanocítico compuesto, que muestra tinción intensa en los nidos del nevo intraepidérmico,... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para diagnosticar melanoma en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con reactivos que se unen específicamente a un panel de marcadores seleccionados que comprende: (i) los polipéptidos ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, y WNT2, o (ii) los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, en el que existe al menos un reactivo que se une con cada marcador; y

(b) determinar si cada uno de los marcadores seleccionados se sobreexpresa o subexpresa o no en la muestra; proporcionando de este modo un diagnóstico para melanoma en el sujeto.

2. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) los reactivos son anticuerpos;

(b) los reactivos son anticuerpos marcados;

(c) los reactivos son anticuerpos y dicha determinación se realiza usando un inmunoensayo enzimático seleccionado entre el grupo que consiste en ensayo inmunohistoquímico y ELISA;

(d) los reactivos son ácidos nucleicos;

(e) los reactivos son cebadores de RT PCR; o

(f) la etapa de determinación comprende el uso de FISH o CGH.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra es una biopsia de piel.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende correlacionar la elevada expresión del marcador con un fenotipo mestastásico para las células de la muestra.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el diagnóstico distingue entre nevos benignos frente a melanoma maligno.

6. Un kit para su uso en el diagnóstico de melanoma en un sujeto, comprendiendo el kit reactivos que se unen específicamente a un panel de marcadores seleccionados que comprende: (i) los polipéptidos ARPC2, FN1, NCOA3, RGS1, SPP1, y WNT2, o (ii) los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos.

7. El kit de la reivindicación 6, en el que los reactivos son anticuerpos.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que los anticuerpos están marcados.

9. El kit de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente reactivos adicionales para la detección usando un inmunoensayo enzimático seleccionado entre el grupo que consiste en ensato inmunohistoquímico y ELISA.

10. El kit de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente reactivos adicionales para la detección usando FISH

o CGH.

11. El kit de la reivindicación 6, en el que los reactivos son ácidos nucleicos o son cebadores de RT PCR.