Detección de patrones individuales de reacción de linfocitos T contra antígenos asociados a tumor (TAA) en pacientes con tumor como base para la vacunación terapéutica individual de pacientes.

Procedimiento para la identificación de antígenos asociados a tumor (TAA) reconocidos específicamente delinfocitos T antitumorales de un paciente con tumor que se encuentra enfermo de un determinado tipo de tumor;

quecomprende

a) proporcionar linfocitos T aislados, que no estén estimulados por contacto con una línea celular tumoral in vitro, dela sangre de un paciente con tumor

b) proporcionar células dendríticas (DC) autólogas y/o linfocitos B (BLC) para los pacientes con tumor, habiéndosetransfectado previamente las DC y los BLC con una elección de ARNm que codifican TAA inmunógenos de linfocitosT cuya expresión en el tipo de tumor es conocido y expresan estos,

c) poner en contacto los linfocitos T con las DC y/o los BLC e

d) identificar aquellos TAA de la elección de TAA transfectados que son reconocidos en la etapa c) por linfocitos Tsobre DC y/o BLC transfectados mediante un ensayo de estimulación y reactividad.

Detección de patrones individuales de reacción de linfocitos T contra antígenos asociados a tumor (TAA) en pacientes con tumor como base para la vacunación terapéutica individual de pacientes La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de antígenos diana preferentes de respuestas a linfocitos T antitumorales autólogos en pacientes con tumor individuales, que comprende: a) proporcionar linfocitos T aislados, que no son estimulados por contacto con una línea celular tumoral in vitro, de la sangre de un paciente con tumor, b) proporcionar células dendríticas (DC) autólogas y/o linfocitos B (BLC) para los pacientes con tumor, transfectando las DC y BLC previamente con una elección de ARNm que codifican TAA inmunógenos de linfocitos T cuya expresión en el tipo de tumor es conocida, y expresan estos, c) poner en contacto los linfocitos T con las DC y/o BLC y d) identificación de aquellos TAA de la elección de TAA transfectados que son reconocidos en la etapa c) por linfocitos T sobre DC y/o BLC transfectados mediante un ensayo de estimulación y reactividad. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de una vacuna contra tumor individualizada o agente terapéutico tumoral individualizado, así como a procedimientos correspondientes para el tratamiento de una enfermedad tumoral con el uso de la vacuna contra tumor individualizada o agentes terapéuticos tumorales individualizados. Las células cancerígenas expresan una multiplicidad de antígenos asociados a tumor (TAA) . En modelos in vitro de humanos se demostró que el reconocimiento de oligopéptidos de TAA mediante linfocitos T (CLT) citotóxicos reactivos frente a tumor conduce a la destrucción de las células tumorales. CLT reconocen oligopéptidos, que se derivan de proteínas de degradación citoplasmáticas y se presentan sobre moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (HLA clases I y II) sobre la superficie de la célula.

Un abordaje especial lo representa la inmunoterapia específica activa, que sensibiliza el sistema inmune del paciente frente a TAA sobre las células tumorales y debe producir una inmunidad a largo plazo. En el marco de la inmunoterapia se administran por tanto sustancias de inoculación (vacunas) a los pacientes, que contienen TAA correspondientes. Los preparados de inmunoterapia cancerígena hasta ahora se limitaban el uso de pocos TAA de 25 las categorías de antígenos de diferenciación y cáncer/línea germinal (antígenos C/G) , que se expresan frecuentemente en tejidos tumorales y de los que se presentan péptidos con los alelos de HLA que se originan más frecuentemente en la población. A este respecto no se comprobó si los pacientes de estudio se encontraban básicamente en la situación de desarrollar una respuesta inmune frente al antígeno de inoculación (Rosenberg y col., Nat. Med. 10: 909, 2004) . Se investigó por parte de grupos de trabajo japoneses en pacientes con carcinoma de 30 pulmón y pacientes con tumores gastrointestinales individualizar la inoculación con péptidos de TAA, ensayándose previamente los linfocitos sanguíneos periféricos en cuanto a reactividad frente a péptidos candidatos de TAA. Solo se usaron para una vacunación péptidos que pudieron demostrarse contra la reactividad (Mine y col., Cancer Sei.

94: 548, 2003; Sato y col., Cancer Sei. 94: 802, 2003) . La elección de péptidos candidatos de TAA se limitó a péptidos unidos a HLA-A2 y HLA-A24. Concretamente estos son los alelos de HLA más frecuentemente habituales 35 en grupos de población asiáticos, de hecho el procedimiento a tal efecto son se lleva a cabo para pacientes HLAA2-y -A24-positivos. Las respuestas de linfocitos T contra péptidos del mismo TAA que se presentan por otros alelos de HLA no se pueden registrar con los procedimientos. Adicionalmente el procedimiento se basó en la estimulación de linfocitos T periféricos de pacientes con los péptidos candidatos. Entre tanto varios estudios han demostrado que tales procedimientos conducen concretamente a la expansión de linfocitos T específicos de péptido,

pero los linfocitos T frecuentemente no reconocen las células tumorales. Esto se basa en que las células tumorales no procesan y presentan el péptido del TAA o los linfocitos T solo reaccionan a altas concentraciones de péptido, que se usaron para las estimulaciones, pero no a las concentraciones claramente inferiores del péptido mostrado naturalmente sobre las células tumorales.

Otros grupos compararon en pacientes con carcinoma de riñón tras nefrectomía el tejido renal normal con el tejido 45 tumoral en lo que se refiere a diferencias en la expresión global de genes y diferencias en la presentación de péptidos de MHC clase I. El análisis de “perfil génico” condujo a la identificación de genes expresados o sobreexpresados específicos de tumor. Los ensayos por espectrometría de masas de péptidos de HLA bioquímicamente purificados aislaron los ligandos de HLA naturales de proteínas específicas de tumor o sobreexpresadas (Weinschenk y col., Cancer Res. 62: 5818, 2002) . Para el “perfil génico” de comparación y el

análisis comparativo de ligadnos de péptido HLA natural de tejidos tumorales y normales se consumen grandes cantidades de ambos tejidos. Por tanto, este procedimiento es adecuado para algunos tipos de tumor y también aplicable en enfermedad tumoral progresiva. Los autores del trabajo citado anteriormente aprecian en un artículo de revista actual que la sensibilidad de su procedimiento les permite identificar de una muestra de tejido como máximo el 4% de los ligandos de HLA naturales (Rammensee, Immunology and Cell Biology 84: 290, 2006) . Se tiene en 55 cuenta que solo la menor parte de los péptidos identificados de este modo presentan realmente una especificidad tumoral suficientemente apreciable, y que no es clara si estos péptidos pueden desencadenar respuestas a células T. Otra posibilidad de la inmunoterapia de cáncer específica del individuo es la inoculación de pacientes con sus propias células tumorales o productos de células tumorales como, por ejemplo, proteína de choque térmico / complejos peptídicos (Srivastava, Curr. Opin Immunol. 18: 201, 2006) . Las células tumorales se pueden inyectar

solas o en mezcla con células dendríticas (O'Rourke y col., Cancer Immunol. Immunother. 52: 387, 2003) . Además se da la posibilidad de hacer las células tumorales inmunógenas antes de la aplicación con procedimientos de terapia génica. La inmunización con células tumorales, solas o en mezcla, o bien fusionadas con células dendríticas,

o proteínas de choque térmico tumorales a las que se unen péptidos de TAA, requiere grandes cantidades de material tumoral para la preparación de vacunas. No es raro en el día a día clínico un factor limitante para una estrategia de este tipo. Para muchos tipos de cáncer se demostró que expresan varios TAA al mismo tiempo. Por ejemplo, se encuentra en el 40% de tumores sanguíneos, 65% de melanomas malignos y de 35 a 37% de tumores de pulmón la expresión simultánea de varios antígenos C/G (Simpson y col., Nat. Rev. Cancer 5: 615, 2005) . En el caso de melanoma maligno más del 90% de los tumores expresan antígenos de diferenciación adicionales (Boon y col., Ann. Rev. Immunol. 24: 175, 2006) . En general pocos de los estudios de inoculación llevados a cabo hasta ahora expresan el carácter individual de interacciones de tumor-huésped en pacientes de cáncer.

El documento DE 102005041616 describe determinados oligopéptidos asociados a melanoma que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos DC8-positivos (CTL) como antígenos péptidos y que comportan una lisis inducida por CTL y/o apoptosis de células tumorales. Adicionalmente la presente invención se refiere al uso de estos oligopéptidos asociados con melanoma en la terapia de cáncer.

El documento DE 10 2005 013 846 describe una estrategia para una identificación y preparación de antígenos expresados asociados a tumor y de los ácidos nucleicos que codifican los mismos. Esta estrategia se basa en el aprovechamiento de bancos de datos de proteínas y ácido nucleico humanos en relación a antígenos potenciales, habituales en la superficie celular, específicos de cáncer. Mediante la búsqueda de datos se establece en primer lugar una lista lo más completa posible de todos los genes conocidos, en los que se estudia siguiendo el principio fundamental de gen a ARNm a proteína la presencia de una o varios dominios de transmembrana. A esto le sigue una búsqueda de homología, una clasificación del impacto en grupos específicos de tejido (entre otros tejidos tumorales) y un examen de la existencia real del ARNm. Finalmente se evalúan las proteínas así identificadas,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación de antígenos asociados a tumor (TAA) reconocidos específicamente de linfocitos T antitumorales de un paciente con tumor que se encuentra enfermo de un determinado tipo de tumor; que comprende a) proporcionar linfocitos T aislados, que no estén estimulados por contacto con una línea celular tumoral in vitro, de la sangre de un paciente con tumor

b) proporcionar células dendríticas (DC) autólogas y/o linfocitos B (BLC) para los pacientes con tumor, habiéndose transfectado previamente las DC y los BLC con una elección de ARNm que codifican TAA inmunógenos de linfocitos T cuya expresión en el tipo de tumor es conocido y expresan estos,

c) poner en contacto los linfocitos T con las DC y/o los BLC e d) identificar aquellos TAA de la elección de TAA transfectados que son reconocidos en la etapa c) por linfocitos T sobre DC y/o BLC transfectados mediante un ensayo de estimulación y reactividad.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la expansión de los linfocitos T que reconocen los antígenos de DC y/o BLC.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la identificación de los antígenos diana reconocidos específicamente de linfocitos T antitumorales del al menos un paciente con tumor en base a los linfocitos T que reconocen los antígenos de las DC y los BLC.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un ensayo de control de la reactividad de loslinfocitos T frente al TAA.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la determinación de los alelos de HLA por los que se presentan los TAA reconocidos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los linfocitos T se aíslan de la sangre periférica del paciente con tumor.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los ARNm se seleccionan de antígenos de varias categorías, seleccionados de antígenos de diferenciación, antígenos C/G, antígenos mutados y antígenos sobreexpresados.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que los antígenos se seleccionan de proteínas específicas de melanocitos o proteínas C/G, como tirosinasa, proteína-2 relacionada con tirosinasa (TRP-2) , gp 100, MAGE, GAGE, BAGE y melan-NMART-1.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el antígeno mutado se selecciona de una proteína de fusión.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se identifica un patrón de expresión de antígeno individual de un paciente con tumor.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se identifica el patrón de expresión de antígeno de un grupo de pacientes con tumor que están enfermos con un determinado tumor.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el tumor determinado es un melanoma maligno.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se identifica el patrón de expresión de antígeno de un grupo de pacientes con tumor que expresan el TAA (“shared”) estructuralmente normal.