Derivados hidrazido de ácido hialurónico.

Un derivado de ácido hialurónico (en lo sucesivo HA) o una de sus sales,

teniendo dicho derivado una parte degrupos carboxi de los residuos D-glucurónicos modificada para dar grupos hidrazido, en el que dicho derivado deácido hialurónico es un compuesto soluble en agua no reticulado, representado por medio de la fórmula HA-CO-NH-NH2

Derivados hidrazido de ácido hialurónico

Campo de la invención La presente invención se refiere a derivados de ácido hialurónico modificados químicamente que contienen grupos 5 hidrazido unidos directamente y a sus derivados marcados. La invención además se refiere a métodos para la preparación de dichos derivados de HA.

Antecedentes de la invención Los glucosaminoglucanos (GAGs) que son parte de la matriz extra celular (ECM) se pueden modificar químicamente y se pueden adaptar para uso médico.

El acido hialurónico (HA) , que es el único GAG no sulfatado conocido, es un componente ubicuo de ECM de todos los tejidos conectivos. Es un polisacárido formado por una unidad de repetición de disacárido. Los componentes de la unidad de disacárido son N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico unidos por medio de enlaces β1-4 y β1-3. HA tiene un intervalo de masas moleculares que ocurren de forma natural desde varios miles a más de 10 millones de Dalton.

Debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, se ha implicado a HA en la homeostasis de agua de tejidos, en la regulación de la permeabilidad de otras sustancias y en la lubricación de articulaciones. HA se une específicamente a proteínas en el ECM y en la superficie celular. Estas interacciones son importantes a la hora de estabilizar la matriz cartilaginosa, en la motilidad celular, proliferación celular, cicatrización de heridas, inflamación así como también en las metástasis cancerígenas (Morra, Biomacromolecules 6:1205-1223, 2005; Vercruysse y Prestwich,

Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 (5) :513-555, 1998; Entwistle et al., J.Cell. Biochem. 61: 569577, 1996) . La naturaleza viscoelástica única de HA junto con su biocompatibilidad y carácter no inmunógeno ha conducido a su uso en un número de aplicaciones clínicas, que incluyen: tratamiento de osteoartritis de rodilla, adyuvante quirúrgico en cirugía ocular, y cicatrización y regeneración de heridas quirúgicas (Goldberg y Buckwalter, Osteoarthritis Cartilage 13 (3) : 216-224, 2005; Brown y Jone, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 19 (3) : 308-318,

2005) .

Se ha propuesto una variedad de modificaciones químicas de HA nativo para mejorar sus propiedades mecánicas y químicas. Los dianas principales para las modificaciones químicas de HA son las funciones hidroxilo y carboxilo.

Las modificaciones por medio de la función hidroxilo se usan principalmente para la preparación de HA reticulado por medio de reacción con agentes de reticulación bifuncionales, por ejemplo divinil sulfona y éteres de diglucidilo (patentes de EE.UU. Nos. 4.582.865 y 4.713.448) .

Las modificaciones de las funcionales carboxílicas se usan principalmente para introducir funcionalidades colgantes que permitan además la unión de fármacos y reactivos bioquímicos (Li et al., Biomacromolecules 5:895-902, 2004; Shu et al., J. Biomed. Mater. Res. 68A:365-375, 2004) . También se pueden usar las modificaciones de los grupos carboxílicos para obtener productos reticulados (Bulpitt y Aeschlimann, J. Biomed. Matter. Res. 47:152-169, 1999) .

Estas modificaciones se llevan a cabo usando hidrazidas o aminas. La activación de las funciones carboxílicas de HA hacia el ataque nucleófilo por parte de hidrazidas o aminas, en medio acuoso, se lleva a cabo principalmente por medio del uso de carbodiimidas solubles en agua, especialmente 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) . Los dos procedimientos principales para llevar a cabo esta activación se conocen en la técnica. El primero fue desarrollado por Prestwich et al y se describe en el documento US 5.616.568, documento US 5.874.417 (Prestwich

et al., J. Controlled Release 53:93-103, 1998, y Pouyani y Prestwich, Bioconjugate Chem. 5:339-347, 1994) . De acuerdo con este procedimiento, se hace reaccionar HA con EDC en condiciones moderadamente ácidas (por ejemplo pH 4, 75) para producir un intermedio de O-acilisourea inestable activo. Las hidrazidas que tienen un pKa bajo de 3-4 y conservan su carácter nucleófilo a pH 4, 75, reaccionan eficazmente con el intermedio de O-acilisourea para producir derivados de hidrazida de los residuos de ácido glucurónico. Por el contrario, las aminas primarias que 45 no son nucleófilas a este pH fallaron a la hora de reaccionar con el intermedio activo que finalmente se reordena para dar un derivado de N-acilurea estable.

El uso de compuesto de dihidrazida tal como dihidrazida adípica (ADH) proporcionó derivados de fórmula HA-CO-NH-NH-CO- (CH2) 4-CO-NH-NH2 (HA-ADH) que tenían múltiples grupos hidrazido colgantes para la posterior derivatización con fármacos, sondas bioquímicas y reactivos de reticulación.

Las últimas publicaciones han demostrado la conjugación del fármaco antitumoral Tuxol al derivado HA-ADH (Luo y Prestwich, Bioconjugate Chem. 10:755-763, 1999) y la preparación de películas de hidrogel como apósito biointeractivo para la cicatrización de heridas a partir de un derivado de HA-ADH reticulado con poli (etilenglicol) propionaldehído (Kirker et al., Biomaterials 23:3661-3671, 2002) .

Se ha desarrollado un segundo procedimiento para la activación de las funciones carboxílicas de HA por parte de Bulpitt y Aeschlimann (J. Biomed. Mater. Res. 47:152-169, 1999) y el documento US 6.630.457. De acuerdo con este procedimiento, se hace reaccionar HA a pH 6, 8 con una combinación de EDC y el aditivo 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) . Inicialmente, la carbodiimida y el anión de carboxilato reaccionan para producir un intermedio de Oacilisourea, que posteriormente reacciona con el aditivo para formar un éster activo más resistente a la hidrólisis y no apto para reordenamiento. Este éster activo reacciona fácilmente con hidrazidas así como también con determinadas aminas (que están presentes en forma no protonada a pH de aproximadamente 5, 5-7, 0) . El uso de este procedimiento permite la formación de derivados de HA con hidrazido colgante, amino así como también otros grupos funcionales.

Los métodos anteriormente mencionados para la introducción de grupos hidrazido colgantes con hidrazida adípica (ADH) introducen una entidad de enlace no natural en el ácido hialurónico. El uso de dichos derivados para aplicaciones clínicas introduce inherentemente estas entidades de enlace no naturales en el organismo (humano) lo que puede conducir a complicaciones inesperadas. Por tanto, resulta altamente deseable evitar el uso de dichos restos de agente de enlace. La presente invención proporciona una forma de introducir grupos hidrazido en HA al tiempo que evita el uso conjunto de agentes de enlace, evitando de este modo las posibles complicaciones indicadas anteriormente.

El documento WO 02006001046 se refiere a nuevos hidrogeles de ácido hialurónico y alfa, betapoliaspartilhidrazida, y las aplicaciones de dichos hidrogeles en los campos biomédico y farmacéutico.

El documento WO 0241877 se refiere a microesferas que comprenden derivados de hidrazida de hialuronato de sodio y a un método para preparar dichas microesferas.

Sumario de la invención Se ha comprobado, de acuerdo con la presente invención, que la propia hidrazina puede reaccionar con ácido hialurónico en presencia de una carbodiimida, dando como resultado de este modo compuestos en los cuales los grupos carboxilo de la molécula de HA están directamente modificados hasta grupos hidrazido.

La presente invención se refiere de este modo, en un aspecto, a un derivado de ácido hialurónico o una de sus sales, teniendo dicho derivado una parte de los grupos carboxi de los residuos de ácido D-glucurónico convertidos en grupos hidrazido, en el que dicho derivado de ácido hialurónico es un compuesto no reticulado y soluble en agua representado por medio de la fórmula HA-CO-NH-NH2.

La presente invención se refiere además a un método para convertir grupos carboxílicos de HA en funciones hidrazido que usan hidrazina de acuerdo con la reacción general descrita en el Esquema 1.

Esquema 1:

De este modo, los derivados de hidrazido HA de la presente invención difieren de las hidrazidas HA descritas previamente en la técnica en que tienen los grupos hidrazido CO-NHNH2 directamente unidos a los residuos de ácido hialurónico de la cadena principal de ácido hialurónico y no por medio de un espaciador.

De acuerdo con la presente invención, se puede determinar la generación de un HA reticulado, insoluble en agua o soluble en agua, modificado con hidrazido por medio del pH de la reacción. Además, el pH de la reacción determina la cantidad de grupos hidrazido en la molécula de HA soluble en agua modificada con hidrazido.

Cuando la reacción se lleva a cabo en condiciones... [Seguir leyendo]

1. Un derivado de ácido hialurónico (en lo sucesivo HA) o una de sus sales, teniendo dicho derivado una parte de grupos carboxi de los residuos D-glucurónicos modificada para dar grupos hidrazido, en el que dicho derivado de ácido hialurónico es un compuesto soluble en agua no reticulado, representado por medio de la fórmula HA-CO-NH

NH2.

2. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 1, que opcionalmente contiene además grupos N-acilurea.

3. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho derivado de ácido hialurónico se conjuga con un agente farmacológica o biológicamente activo, por ejemplo un agente farmacológica o 10 biológicamente activo que está seleccionado entre el grupo que consiste en un antibiótico, un anti-infeccioso, un anti-microbiano, un anti-vírico, un citostático, un anti-tumoral, un anti-inflamatorio, un agente de cicatrización de heridas, un anestésico, un agonista colinérgico, un antagonista colinérgico, un agonista adrenérgico, un antagonista adrenérgico, un anti-trombótico, un anti-coagulante, un hemostático, un fibrinolítico, un agente trombolítico, un factor de crecimiento, una citocina, un anticuerpo, una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptico, un péptido, un polinucleótido y un polímero.

4. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con una de las reivinidicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido hialurónico tiene un peso molecular medio de aproximadamente 800 a aproximadamente 4.000.000 Da en peso.

5. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho derivado de ácido

hialurónico tiene entre 0, 5 % y 70 % de restos carboxi de grupos D-glucurónicos directamente convertidos en grupos 20 hidrazido.

6. Un derivado de ácido hialurónico que comprende un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos una parte de los grupos hidrazido se unen covalentemente a un marcador detectable que tiene un grupo funcional capaz de formar un enlace covalente con la función hidrazido, por ejemplo un marcador detectable seleccionado entre el grupo que consiste en: marcadores fluorescentes, marcadores fosforescentes, marcadores de afinidad, marcadores de Resonancia de Espín Electrónico (ESR) , nanopartículas de metal y semiconductor, marcadores colorimétricos espectrales, proteínas, enzimas, oligonucleótidos y polinucleótidcos, perlas poliméricas.

7. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el marcado detectable es un marcador detectable seleccionado entre la siguiente lista no limitante: fluoresceína, carboxi fluoresceína, 30 diclorotriazina de fluoresceína (5-DTAF) , naftofluoresceína, un derivado de isotioacianato de fluoresceína (FITC) representado por medio de la fórmula HA-CO-NH-NH-CS-NH-Fluoresceína, rodamina, verde de rodamina, tetrametil rodamina, rojo de Texas, perileno, pireno, antraceno, naftaleno (por ejemplo, dansilo) , estilbeno, (bis) -benzooxazol, derivados de cumarina (por ejemplo derivados de Alexa Fluor (R) ) , derivados de BODIPY (R) , piridiloxazoles, dixogenina, fenoxazina, triarilmetanos, xanteno, flavina, porfirina, cianina, naftocianina, complejos de lantánidos,

complejos de metales de transición, microesferas excitables con luz UV, proteína fluorescente verde.

8. Un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho derivado de ácido hialurónico está en forma de un hidrogel.

9. Una composición farmacéutica que comprende un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y que opcionalmente comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o

que opcionalmente comprende además un agente farmacológicamente activo químicamente conjugado o sin conjugar, siendo la composición farmacéutica opcionalmente capaz de proporcionar una liberación lenta o una liberación prolongada del agente farmacéuticamente activo.

10. Una composición cosmética que comprende un derivado de ácido hialurónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende un vehículo cosméticamente aceptable, y que opcionalmente 45 comprende además un agente cosmético.

11. Un método de preparación de un derivado de ácido hialurónico marcado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende hacer reaccionar el derivado de HA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 con un marcador aceptable que contiene un grupo específico de amina o reactivo de amina; por ejemplo un marcador fluorescente que contiene un grupo específico de amina o reactivo de amina, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC) .

12. Un método para la preparación de un derivado de ácido hialurónico de la reivindicación 1 en forma soluble en agua y no reticulada, que comprende hacer reaccionar ácido hialurónico activado por una carbodiimida, por ejemplo hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) , con hidrazina, a un intervalo de pH de 5, 6-7, 5, preferentemente de 5, 7-5, 9.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la reacción se lleva a cabo en un tampón acuoso o en 55 una mezcla de tampón acuoso y disolvente orgánico miscible en agua; por ejemplo un disolvente aprótico dipolar, por ejemplo un disolvente aprótico dipolar seleccionado entre el grupo que consiste en sulfóxido de dimetilo, N, Ndimetilformamida, 1-metil-2-pirrolidona, 1, 1, 3, 3-tetrametilurea, hexametilfosforamida y acetonitrilo.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la reacción se lleva a cabo en una etapa por medio de la reacción de una mezcla de ácido hialurónico, una carbodiimida e hidrazina.