Derivados del inositol-fosfato y procedimiento de detección del inositol-1-fosfato.

Análogo funcional del IP1 de fórmula (I):**Fórmula**

en la cual:

los substituyentes R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son seleccionados entre: -OH, -OPO32-, -OPO(OH)2 u OPO(OH)O-,

-(OCONH)q-L-G u -(OCONH)q-L-M, a condición de que uno de los substituyentes R1 a R6 sea un grupo -OPO3

2-, -OPO(OH)2 u OPO(OH)O- y uno de los otros substituyentes R1 a R6 sea uno de los grupos -(OCONH)q-L-G u -(OCONH)q-L-M, siendo los otros substituyentes R1 a R6 grupos -OH;

donde:

q es igual a 1,

L es un grupo de unión,

G es un grupo de reacción y

M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, uninmunógeno, un soporte sólido o un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entrelos miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una solahebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario.

Derivados del inositol-fosfato y procedimiento de detección del inositol-1-fosfato La presente invención tiene por objeto derivados del inositol-fosfato y proporciona nuevas herramientas que permiten el estudio del ciclo de los inositol-fosfatos y, por lo tanto, indirectamente el estudio de los receptores de siete dominios de transmembrana (receptores 7TM) copulados a la fosfolipasa C (PLC) , de los receptores que tienen una actividad de tirosina kinasa y, en general, de las enzimas implicadas en las variaciones de la concentración intracelular de IP1.

El término "inositol-fosfato" designa un compuesto de la familia de los ciclitoles de tipo ciclohexano que lleva un grupo hidroxilo en cada carbono (1, 2, 3, 4, 5, 6-hexahidroxiciclohexanos) . El compuesto natural más representado es el mio-inositol, cuyos grupos hidroxilo en las posiciones 1, 2, 3 y 5 están situados en una de las caras del anillo de ciclohexano y cuyos dos grupos hidroxilo en las posiciones 4 y 6 están situados en la otra cara. Los compuestos naturales producidos en el curso del ciclo de los fosfatos de inositol son fosfatos de D-mio-inositol, cuyo fosfato se encuentra en la posición 1, 3, 4 ó 5 del anillo del inositol. Estos compuestos son generalmente denominados «IP1», en contraposición, por ejemplo, al IP2 (bisfosfato de inositol) o al IP3 (trisfosfato de inositol) . A continuación, estos compuestos serán respectivamente designados en el texto por los acrónimos siguientes: IP1 (1) , IP1 (3) , IP1 (4) e IP1 (5) y tienen por fórmulas:

El IP1 (1) y el IP1 (4) son los intermediarios más estudiados.

Se describieron ya derivados del inositol-fosfato en los documentos de la técnica anterior siguientes:

-Essen et al., ACS SYMPOSIUM SERIES, WASHINGTON DC, US (1999) , vol. 718, páginas 121-136; 30 -Cottaz et al., JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, PERKIN TRANSACTIONS 1, CHEMICAL SOCIETY, LETCHWORTH, GB (1995) , páginas 1673-1678; -Berlin et al., TETRAHEDRON, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL (1991) , vol. 47, n° 1, páginas 1-20; -Krauter et al., MOLECULAR PHARMACOLOGY (2001) , 59 (5) , páginas 1086-1093;

-Chen et al., JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY (1998) , 63 (19) , páginas 6511-6522; -Cobb et al., TETRAHEDRON (1991) , 47 (1) , páginas 21-30; -Falck et al., TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, junio de 2000, vol. 41, n° 22,

páginas 4271-4275; -WO 01/85740 A; 40 -WO 03/087109 A; -US 2004/106158 A1.

Ninguno de estos documentos describe o sugiere los análogos del IP1 de la presente invención tales como los definidos aquí a continuación.

Los receptores de siete dominios de transmembrana copulados a las proteínas G (GPCR, 7 TM) están implicados en numerosos procesos patológicos. Tienen especialmente como función transmitir las señales del medio extracelular hacia el medio intracelular a través de la membrana celular. Las moléculas que desempeñan un papel de mensajero en el organismo, tales como las hormonas, los factores de crecimiento, las citoquinas o también los 50 neurotransmisores, se unirán a estos receptores y desencadenarán una cascada de acontecimientos en el interior

de la célula.

El estudio del comportamiento de estos receptores en presencia de compuestos susceptibles de ser utilizados como medicamentos es uno de los métodos de elección que permiten descubrir nuevos tratamientos. Una de las vías ampliamente utilizada para estudiar la activación o la desactivación de estos receptores consiste en medir las variaciones de concentración de los mensajeros intracelulares durante la unión de medicamentos potenciales a estos receptores. Las herramientas que permiten medir las variaciones de estos mensajeros intracelulares son, pues, muy preciadas en la investigación farmacéutica, pero también en los trabajos de investigación fundamental destinados a comprender mejor los mecanismos de señalización inter/intracelular.

La unión de un ligando agonista a un receptor 7TM modificará la estructura terciaria del receptor, lo que induce a su vez una modificación de la conformación de una proteína G copulada al receptor. La activación de esta proteína G provocará a su vez, según los casos, o bien la activación, o bien la inhibición, de un efector, lo que producirá un segundo mensajero intracelular, como el AMPc o el IP3.

Uno de estos efectores es la fosfolipasa C (PLC) , que induce la hidrólisis del 4, 5-bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2) de la membrana a diacilglicerol (DAG) y a trisfosfato de inositol (IP3) . El IP3 a su vez provoca un aumento de la concentración de Ca2+ intracelular por la activación de receptores del IP3 presentes en el retículo endoplásmico. Este IP3 tiene un tiempo de vida media muy rápido (menos de un minuto) , ya que, o bien se fosforila inmediatamente en su posición 3 para dar el 1, 3, 4, 5-tetrakisfosfato de inositol (IP4) , o bien se degrada en IP2 por una fosfatasa específica. El IP4 y el IP2 se degradan entonces rápidamente por una serie de enzimas (5-, 3-, 4-o 1-PPASE) , para dar mayoritariamente IP1 (1) e IP1 (4) , pero también IP1 (3) e IP1 (5) . Estos monofosfatos de inositol tienden a acumularse antes de degradarse en inositol por la acción de la inositol monofosfatasa (IMPasa) . Esta última degradación puede ser artificialmente ralentizada por la utilización de sales de litio inhibidoras de la IMPasa [Parthasarathy et al. Life Sci. (1994) , 54, 1127-1142], lo que permite una acumulación de IP1 en la célula y facilita la titulación eventual de este intermediario. El conjunto de las transformaciones de estos derivados del inositol se denomina ciclo del inositol. El IP1 producido por la activación del ciclo del inositol es uno de estos mensajeros intracelulares y su titulación permite detectar la modulación de la vía de señalización que implica a la fosfolipasa C.

Las titulaciones de IP1 descritas en la literatura están principalmente basadas en métodos radioisotópicos [Berridge et al. Biochem J. (1983) 212, 473-82]. Se incuban células en presencia de inositol tritiado (48 h) y de cloruro de litio para evitar la degradación enzimática del IP1 formado. Se tratan las células con un agente estimulante de los receptores de membrana (neuromediador agonista) y se lisan luego, y se deposita el inositol, así como el conjunto de los fosfatos de inositol (IP3, IP2, IP4, IP1) de la fracción citosólica, sobre una columna intercambiadora de aniones y se eluye esta columna con un gradiente de formiato de amonio; se recoge el IP1 marcado con tritio a una fuerza iónica dada y la radiactividad medida permite así estimar la cantidad de IP1 formada por la estimulación de las células. Esta técnica, bastante difícil de controlar, tiene el inconveniente de utilizar radioisótopos y no permite una cuantificación absoluta del IP1 formado; además, este método no permite un gran número de titulaciones simultáneas. No obstante, se ha podido miniaturizar [Chengalvala et al. J. Biochem. Biophys. Methods (1999) , 38, 163-170] para responder parcialmente a las necesidades, tales como el cribado de alto rendimiento de moléculas.

Se han propuesto otras técnicas que utilizan los inosítidos tritiados [Zheng W et al. J. Biomol. Screen. (2004) 9 (2) : 132-40], [Brandish P.E. et al. Anal. Biochem. (2003) 313, 311-318] y [Liu JJ et al. Anal. Biochem., 1 de Julio de 2003; 318 (1) : 91-9]; la diferencia con la técnica isotópica anterior reside esencialmente a nivel de la medición. En estas técnicas, se utiliza una prueba de escintigrafía de proximidad, conocida bajo la denominación inglesa «Scintillation Proximity assay» (SPA) , que pone en juego una fase sólida recubierta de un complejo metálico que posee una afinidad por los grupos fosfato [Liu et al, Anal. Biochem. (2003) ]. En este caso, todos los intermediarios fosforilados (IP1, IP2, IP3, etc.) son titulados conjuntamente y la selectividad no es posible más que entre el inositol y los fosfatos de inositol. Esta técnica está mejor adaptada al cribado de alto rendimiento y permite realizar numerosas titulaciones simultáneas, pero muy evidentemente carece de selectividad y no permite titular el IP1 solo.

Para poder realizar una titulación no radiactiva del IP1, se ha de disponer de un análogo funcionalizado del IP1 de estereoquímica definida. Como el mio-inositol es una molécula que posee un plano de simetría, éste no es, por lo tanto, ópticamente activo (compuesto llamado "meso" cuya actividad óptica es destruida por la existencia de una simetría) y su fosforilación puede dar lugar, por ejemplo, a dos enantiómeros posibles, que son el D-mio-inositol-1fosfato y el L-mio-inositol-1-fosfato, produciéndose el enantiómero D en la célula por el ciclo del inositol. Los derivados del IP3 descritos en la literatura [Prestwich et al., J. Amer. Chem.... [Seguir leyendo]

1. Análogo funcional del IP1 de fórmula (I) :

en la cual:

los substituyentes R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son seleccionados entre: -OH, -OPO32-, -OPO (OH) 2 u OPO (OH) O-,

- (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M, a condición de que uno de los substituyentes R1 aR6 sea un grupo -OPO32-, -OPO (OH) 2 u OPO (OH) O-y uno de los otros substituyentes R1 aR6 sea uno de los grupos (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M, siendo los otros substituyentes R1 aR6 grupos -OH; donde:

q es igual a 1,

L es un grupo de unión, G es un grupo de reacción y M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un inmunógeno, un soporte sólido o un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario.

2. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (II) : 25

en la cual:

uno de los substituyentes R1, R3, R4 o R5 es seleccionado entre los grupos -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-, uno de los otros substituyentes R1-R6 es seleccionado entre los grupos - (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M y los otros substituyentes son grupos OH, donde:

q es igual a 1, L es un grupo de unión, G es un grupo de reacción y M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un inmunógeno, un soporte sólido o un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario.

3. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (III) :

en la cual:

uno de los substituyentes R1, R4 y R5 es seleccionado entre: -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-, R3 es seleccionado entre: - (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M y los otros substituyentes R1, R4 yR5 son grupos -OH,

donde: q es igual a 1, L es un grupo de unión, G es un grupo de reacción y M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un inmunógeno, un soporte sólido o un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario. 20

4. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (IV) :

en la cual:

uno de los substituyentes R1, R3 y R4 es seleccionado entre: -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-, R5 es seleccionado entre: - (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M y los otros dos substituyentes R1, R3 yR4 son grupos -OH,

donde: q es igual a 1, L es un grupo de unión, G es un grupo de reacción y M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un inmunógeno, un soporte sólido y un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario. 40

5. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (V) :

en la cual:

uno de los substituyentes R1, R3, R4 y R5 es seleccionado entre: -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-, R2 es seleccionado entre: - (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M y los otros substituyentes R1, R3, R4 yR5 son grupos -OH;

donde: q es igual a 1, L es un grupo de unión, G es un grupo de reacción y M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un inmunógeno, un soporte sólido y un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario. 20

6. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula (VI) :

en la cual:

uno de los substituyentes R1, R3 y R5 es seleccionado entre: -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-,

R4 es seleccionado entre: - (OCONH) q-L-G u - (OCONH) q-L-M y

los otros substituyentes R1, R3 yR5 son grupos OH, 30 donde:

q es igual a 1,

L es un grupo de unión,

G es un grupo de reacción y

M es una substancia o molécula conjugada seleccionada entre el grupo siguiente: un rastreador, un 35 inmunógeno, un soporte sólido y un miembro de un par de compañeros de unión seleccionado entre los miembros de los pares siguientes:

avidina o estreptavidina/biotina, hapteno/anticuerpo y oligonucleótido de una sola hebra/oligonucleótido de una sola hebra complementario.

7. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por seleccionar el par hapteno/anticuerpo entre los pares 6HIS/anticuerpo anti-6HIS, FLAG/anticuerpo anti-FLAG, DNP/anticuerpo anti-DNP, GST/anticuerpo anti-GST, Cmyc/anticuerpo anti-Cmyc y HA/anticuerpo anti-HA.

8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por seleccionar el grupo R1 entre los grupos -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-.

9. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por seleccionar el grupo R4 entre los grupos -OPO32-, -OPO (OH) 2 u -OPO (OH) O-. 10

10. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por ser el grupo de unión L un enlace covalente sencillo o un brazo de espaciamiento que tiene de 1 a 20 átomos diferentes del hidrógeno seleccionados entre los átomos de carbono, nitrógeno, fósforo, oxígeno y azufre, siendo este grupo de unión lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, y estando constituido por una combinación de enlaces seleccionados entre: los enlaces carbono-carbono, que pueden ser sencillos, dobles, triples o aromáticos; los enlaces carbono-nitrógeno; los enlaces nitrógeno-nitrógeno; los enlaces carbono-oxígeno; los enlaces carbonoazufre; los enlaces fósforo-oxígeno; los enlaces fósforo-nitrógeno; los enlaces éter; los enlaces éster; los enlaces tioéter; los enlaces amina; los enlaces amida; los enlaces carboxamida; los enlaces sulfonamida; los enlaces urea; los enlaces uretano; los enlaces hidrazina y los enlaces carbamoílo.

11. Compuesto según la reivindicación 10, caracterizado por tener el grupo de unión L de 1 a 20 átomos diferentes del hidrógeno, seleccionados entre los átomos de carbono, nitrógeno, fósforo, oxígeno y azufre, y por tener además al menos un enlace seleccionado entre los enlaces éter, tioéter, carboxamida, sulfonamida, hidrazina, amina y éster y enlaces aromáticos o heteroaromáticos.

12. Compuesto según la reivindicación 10, caracterizado por seleccionar el grupo de unión L entre las cadenas substituidas o no substituidas siguientes: polimetileno, arileno, alquilarileno, arilenalquilo o ariltío.

13. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por seleccionar el grupo de reacción G entre los

grupos derivados de los compuestos siguientes: una acrilamida, una amina activada (por ejemplo, una cadaverina o una etilendiamina) , un éster activado, un aldehído, un haluro de alquilo, un anhídrido, una anilina, una azida, una aziridina, un ácido carboxílico, un diazoalcano, una haloacetamida, una halotriazina, tal como monoclorotriazina o diclorotriazina, una hidrazina (incluyendo en ella las hidrazidas) , un imidoéster, un isocianato, un isotiocianato, una maleimida, un haluro de sulfonilo o tiol, una cetona, una amina, un haluro de ácido, un éster de hidroxisuccinimidilo,

un éster de hidroxisulfosuccinimidilo, un azidonitrofenilo, un azidofenilo, una 3- (2-piridilditio) propionamida y glioxal, y en particular los grupos de fórmula:

donden varía de0 a8y p es igual a 0 ó1y Ar es un heterociclode5 ó6 eslabones que tienede 1 a 3 heteroátomos, eventualmente substituido por un átomo de halógeno.

14. Compuesto según la reivindicación 1 a 9, caracterizado por ser L un alquilenilo C3-C10 y por ser G un grupo 15 amina.

15. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

16. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un rastreador.

17. Compuesto según la reivindicación 16, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un

rastreador seleccionado entre: un radioisótopo, una molécula radiomarcada, un compuesto fluorescente, un compuesto luminescente, una enzima, un cromóforo fluorescente, un cromóforo absorbente de la luz o cualquier otra molécula o substancia que permita una medición cuantitativa directa o indirecta, a condición de que, cuando M es un radioelemento y L es un enlace sencillo, entonces M sea diferente del tritio.

18. Compuesto según la reivindicación 17, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un radioisótopo seleccionado entre: 125I, 32P, 35S o una molécula marcada con uno de los isótopos siguientes: 125I, 32P, 5 35S o 3H, a excepción de un grupo fosfato marcado con 32P.

19. Compuesto según la reivindicación 17, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M una enzima o un compuesto fluorescente seleccionado entre: las rodaminas, las cianinas, las escuaraínas, los BODIPY, las fluoresceínas, los compuestos de la familia de los AlexaFluor, los quelatos de tierras raras, los criptatos de tierras raras, los puntos cuánticos, las ficobiliproteínas, tales como la B-ficoeritrina, la R-ficoeritrina, la C-ficocianina y la aloficocianina, la GFP y sus derivados, una proteína fluorescente de coral, una peroxidasa y una luciferasa.

20. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un compuesto inmunógeno. 15

21. Compuesto según la reivindicación 20, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un compuesto inmunógeno seleccionado entre: la seroalbúmina bovina (BSA) , la BSA catiónica (cBSA) , la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) , la tiroglobulina, la ovoalbúmina, un liposoma, un polímero de L-lisina o de ácido Lglutámico, el ficoll, el dextrano o también el polietilenglicol.

22. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un soporte sólido.

23. Compuesto según la reivindicación 22, caracterizado por ser la substancia o molécula conjugada M un soporte

sólido seleccionado entre: microperlas magnéticas o no, pocillos de microplaca, tubos, una fase sólida o una microesfera fluorescente.

24. Compuesto de fórmula:

en la cual: R1 es un grupo -OPO (OR7) 2 y 35 R7, R8, R9 yR10 son idénticos o diferentes y son grupos protectores no ácido sensibles.

25. Compuesto de fórmula:

26. Compuesto según una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado por ser R8, R9 yR10 grupos protectores seleccionados entre los residuos de ésteres, tales como el pivaloílo, el benzoílo, el cloroacetilo, el fenilacetilo o el benciloxicarbonilo, los residuos de silil éteres, tales como el trimetilsililoxi, el trietilsililoxi, el terc-butildimetilsililoxi o el terc-butildifenilsililoxi, el benciloxi, el p-metoxibenciloxi, el 3, 4-dimetoxibenciloxi, los aliloxi y los aliloxicarboxi, y R7 es

40 en la cual:

45 R1 es un grupo -OPO (OR7) 2 y R7, R8, R9 yR10 son idénticos o diferentes y son grupos protectores no ácido sensibles.

un grupo bencilo, o bien los dos grupos R7 forman juntos un grupo o-xilileno.

27. Anticuerpo policlonal o monoclonal anti-IP1 obtenido por inmunización de un mamífero con un compuesto según una de las reivindicaciones 20 ó 21.

28. Kit de titulación del IP1 que incluye:

un análogo de IP1 según las reivindicaciones 1 a 9 y

un ligando específico del IP1,

estando uno al menos de estos elementos marcado directa o indirectamente con un rastreador. 15

29. Kit según la reivindicación 28, caracterizado por incluir además un agente bloqueante de ciertas enzimas del ciclo del inositol, en particular cloruro de litio.

30. Kit según la reivindicación 28, caracterizado por ser el ligando específico del IP1 un anticuerpo monoclonal o 20 policlonal específico del IP1.

31. Kit de titulación del IP1 según la reivindicación 28, caracterizado por seleccionar el rastreador entre: un radioelemento, un compuesto fluorescente, un compuesto luminescente, una enzima, un cromóforo fluorescente, un cromóforo absorbente de la luz o cualquier otra molécula o substancia que permita una medición cuantitativa directa o indirecta.

32. Kit según la reivindicación 28, caracterizado por contener un compuesto donador y un compuesto aceptor que emite una señal resultante de una transferencia de proximidad con el compuesto donador, estando el compuesto donador unido directa o indirectamente al análogo del IP1 y estando el compuesto aceptor unido directa o indirectamente al ligando específico del IP1.

33. Kit según la reivindicación 28, caracterizado por contener un compuesto donador y un compuesto aceptor que emite una señal resultante de una transferencia de proximidad con el compuesto donador, estando el compuesto aceptor unido directa o indirectamente al análogo del IP1 y estando el compuesto donador unido directa o indirectamente al ligando específico del IP1.

34. Kit según una de las reivindicaciones 28 ó 29, caracterizado por ser el compuesto donador y el compuesto aceptor compuestos fluorescentes, por ser la transferencia de proximidad una transferencia de energía y por ser la señal emitida una señal fluorescente.

35. Procedimiento de detección del IP1 contenido en una muestra, caracterizado por incluir las etapas siguientes:

contacto de la muestra con un ligando específico del IP1 y

detección de los complejos formados entre dicho ligando y el IP1 presente en la muestra. 45

36. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por estar marcado el ligando específico del IP1 directa o indirectamente con un rastreador.

37. Procedimiento según la reivindicación 35, que incluye además una etapa de introducción en la muestra de una 50 cantidad conocida de IP1 tritiado o de IP1 marcado directa o indirectamente con un rastreador.

38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 36 ó 37 caracterizado por seleccionar el rastreador entre: un radioelemento, un compuesto fluorescente, un compuesto luminescente, una enzima, un cromóforo fluorescente, un cromóforo absorbente de la luz o cualquier otra molécula o substancia que permita una medición cuantitativa directa 55 o indirecta.

39. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por estar conjugado el ligando específico del IP1 directa o indirectamente con un compuesto donador, por poner en contacto la muestra con IP1 conjugado directa o indirectamente con un compuesto aceptor y por medir la señal emitida por el compuesto aceptor, resultando esta 60 señal de una transferencia de proximidad entre el donador y el aceptor y siendo inversamente proporcional a la cantidad de IP1 presente en la muestra.

40. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por estar conjugado el ligando específico del IP1

directa o indirectamente con un compuesto aceptor, por poner en contacto la muestra con IP1 conjugado directa o indirectamente con un compuesto donador y por medir la señal emitida por el compuesto aceptor, resultando esta señal de una transferencia de proximidad entre el donador y el aceptor y siendo inversamente proporcional a la cantidad de IP1 presente en la muestra.

41. Procedimiento según una de las reivindicaciones 35 a 40, caracterizado por ser el compuesto donador y el compuesto aceptor compuestos fluorescentes, por ser la transferencia de proximidad una transferencia de energía y por ser la señal emitida una señal fluorescente.

42. Procedimiento según la reivindicación 41, caracterizado por ser el compuesto fluorescente donador un criptato

o un quelato de tierras raras y seleccionar el compuesto fluorescente aceptor entre: las cianinas, las rodaminas, las escuaraínas, los BODIPY, las fluoresceínas, los AlexaFluor, los puntos cuánticos, las ficobiliproteínas, tales como la B-ficoeritrina, la R-ficoeritrina, la C-ficocianina y la aloficocianina, la GFP y sus derivados y una proteína fluorescente de coral.

43. Procedimiento de detección del IP1 según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 42, caracterizado por ser el ligando específico del IP1 un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento de anticuerpo, una proteína, un péptido o un aptámero.

44. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por poner la muestra en contacto con un anticuerpo específico del IP1 y un análogo del IP1 fijado sobre un soporte sólido, y que incluye además las etapas siguientes:

lavado del soporte sólido, adición de un anticuerpo antiespecie que reconoce el anticuerpo anti-IP1, estando marcado dicho anticuerpo antiespecie con un rastreador, y detección del anticuerpo antiespecie, siendo la cantidad de anticuerpo antiespecie inversamente proporcional a la cantidad de complejo anticuerpo anti-IP1/IP1 presente en la muestra.

45. Procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por poner en contacto la muestra con anticuerpo específico del IP1 fijado a un soporte sólido y con un análogo del IP1 marcado con un rastreador, y que incluye además las etapas siguientes:

- contacto de la muestra con un anticuerpo anti-IP1 fijado sobre un soporte sólido y con un análogo del IP1 marcado con un rastreador, y que incluye además las etapas siguientes: -lavado del soporte sólido y -detección del IP1 marcado, siendo la cantidad de IP1 marcado inversamente proporcional a la cantidad de complejo anticuerpo anti-IP1/IP1 presente en la muestra.

46. Procedimiento de cribado de compuestos agonistas de un receptor de membrana cuya activación conlleva la producción de IP1 en la célula, incluyendo este procedimiento las etapas siguientes:

(i) Adición del compuesto de ensayo a un medio de cultivo que contiene células que expresan un receptor cuya activación conlleva la producción de IP1.

(ii) Determinación de la cantidad de IP1 con ayuda de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43.

(iii) Comparación de la cantidad de IP1 determinada en presencia y en ausencia de este compuesto, permitiendo un aumento de la cantidad de IP1 identificar el compuesto de ensayo como agonista de dicho receptor.

47. Procedimiento según la reivindicación 46, caracterizado por incluir la etapa (ii) la adición al medio de un anticuerpo anti-IP1 marcado con un compuesto fluorescente donador o aceptor, así como la adición de IP1 marcado con un compuesto fluorescente aceptor o, respectivamente, donador, y por consistir la determinación de la cantidad de IP1 en medir la señal luminosa resultante de la transferencia de energía entre los dos compuestos fluorescentes, y por incluir la etapa (iii) la comparación de la señal medida en presencia y en ausencia de compuesto de ensayo, permitiendo una disminución de la señal medida en presencia de compuesto de ensayo identificar este compuesto como un agonista de dicho receptor.

48. Procedimiento de cribado de compuestos antagonistas de un receptor de membrana cuya activación conlleva la producción de IP1 en la célula, incluyendo este procedimiento las etapas siguientes:

(i) Adición del compuesto de ensayo a un medio de cultivo que contiene células que expresan un receptor cuya activación conlleva la producción de IP1.

(ii) Adición de un agonista conocido de dicho receptor.

(iii) Determinación de la cantidad de IP1 con ayuda de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44.

(iv) Comparación de la cantidad de IP1 determinada en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo,

permitiendo una disminución de la cantidad de IP1 identificar el compuesto de ensayo como antagonista de dicho receptor.

49. Procedimiento según la reivindicación 48, caracterizado por incluir la etapa (iii) la adición al medio de un anticuerpo anti-IP1 marcado con un compuesto fluorescente donador o aceptor, así como la adición de IP1 marcado con un compuesto fluorescente aceptor o, respectivamente, donador, y por consistir la determinación de la cantidad de IP1 en medir la señal luminosa resultante de la transferencia de energía entre los dos compuestos fluorescentes, y por incluir la etapa (iv) la comparación de la señal medida en presencia y en ausencia de compuesto de ensayo, permitiendo un aumento de la señal medida en presencia de compuesto de ensayo identificar este compuesto como un antagonista de dicho receptor.

50. Procedimiento de cribado de compuestos agonistas inversos de un receptor de membrana constitutivamente activo, incluyendo este procedimiento las etapas siguientes:

(i) Adición del compuesto de ensayo a un medio de cultivo que contiene células que expresan un receptor 20 constitutivamente activo y cuya actividad conlleva la producción de IP1.

(ii) Determinación de la cantidad de IP1 con ayuda de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44.

(iii) Comparación de la cantidad de IP1 determinada en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo,

permitiendo una disminución de la cantidad de IP1 identificar el compuesto de ensayo como agonista inverso 25 de dicho receptor.

51. Procedimiento según la reivindicación 50, caracterizado por incluir la etapa (ii) la adición al medio de un anticuerpo anti-IP1 marcado con un compuesto fluorescente donador o aceptor, así como la adición de IP1 marcado con un compuesto fluorescente aceptor o, respectivamente, donador, y por consistir la determinación de la cantidad

de IP1 en medir la señal luminosa resultante de la transferencia de energía entre los dos compuestos fluorescentes, y por incluir la etapa (iii) la comparación de la señal medida en presencia y en ausencia de compuesto de ensayo, permitiendo un aumento de la señal medida en presencia de compuesto de ensayo identificar este compuesto como un agonista inverso de dicho receptor.

FIGURA 2

2, 3, 6-Tri-O-bencil-mio-inositol

1, 3, 4-Tri-O-bencil-mio-inositol (14)

4, 5-O-carbonato (15)

2, 3, 6-Tri-O-bencil-mio-inositol

mio-Inositol-4, 5-O-carbonato-1-fosfato (17)

4, 5-O-carbonato-1-fosfato (16)

5. O- (5-Aminopentilcarbamoil) -mio

4. O- (5-Aminopentilcarbamoil) -mio

inositol-1-fosfato (19)

inositol-1-fosfato (18)

FIGURA 4

2. O-Alil-3, 4, 5-tri-O-bencil-6-O-2-O-Alil-3, 4, 5-tri-O-bencil-6-O (4-metoxibencil) -D-quiro-inositol (25) (4-metoxibencil) -D-mio-inositol (26)

Derivado imidazolilo 2-O-Alil-3, 4, 5-tri-O-bencil-1-O-2-O-Alil-3, 4, 5-tri-O-bencil-1-O (dibencilfosfono) -6-O- (4 (dibencilfosfono) -D-mio-inositol (28) metoxibencil) -D-mio-inositol (27) 6-O- (5-Aminopentil) carbamoil-D-mio-inositol1-fosfato (30)

FIGURA 7

Procedimiento de síntesis de análogos del mio-inositol-4-fosfato que llevan un grupo de reacción G en posición 6

FIGURA 7 (CONTINUACIÓN)

FIGURA 8

Procedimiento de síntesis de análogos del mio-inositol-4-fosfato que llevan un grupo de reacción G en posición 1.

FIGURA 9

Procedimiento de síntesis de análogos del mio-inositol-4-P que llevan un grupo de reacción en posición 2 ó 3

FIGURA 10