Composiciones y métodos para la supresión de polinucleótidos diana de Lepidoptera.

Una célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un polinucleótido heterólogo quecomprende un elemento silenciador conectado operablemente a un promotor activo en dicha célula vegetal,

endonde dicho elemento silenciador comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos del SEQ IDNO: 1,

en donde dicho elemento silenciador, cuando es ingerido por una plaga del orden Lepidoptera, reduce el nivel deuna secuencia diana en dicha plaga a menos de 80% del nivel de la secuencia diana en una plaga de control que noha ingerido el elemento silenciador y de ese modo controla la plaga del orden Lepidoptera.

Composiciones y métodos para la supresión de polinucleótidos diana de Lepidoptera Campo de la invención La presente invención se refiere en general a métodos de la biología molecular y al silenciamiento génico para el control de plagas Antecedentes de la invención Las plagas de insectos son un grave problema en la agricultura. Destruyen millones de hectáreas de cultivos básicos tales como maíz, habas de soja, guisantes, y algodón. Anualmente, estas plagas causan más de 100.000 millones de dólares en daños a los cultivos solamente en los Estados Unidos. En una batalla estacional en curso, los granjeros deben aplicar miles de millones de litros de plaguicidas sintéticos para combatir estas plagas. Otros métodos empleados en el pasado liberaron actividad insecticida por medio de microorganismos o genes derivados de microorganismos expresados en plantas transgénicas. Por ejemplo, se sabe que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus poseen actividad plaguicida contra una amplia gama de plagas de insectos incluyendo Lepidoptera, Oi ptera, Coleoptera, Hemipter a, y otras. De hecho, los plaguicidas microbianos, concretamente aquellos obtenidos de cepas de Bacillus, han jugado un importante papel en la agricultura como alternativas para el control químico de plagas. Los científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con una resistencia a los insectos incrementada por medio del diseño genético de plantas de cultivo para producir proteínas insecticidas a partir de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón diseñadas genéticamente para producir toxinas Cr y (véanse, p. ej., Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59 (3) :417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (3) :775-806) son ampliamente utilizadas en la actualidad en la agricultura Americana y han proporcionado al granjero una alternativa a los métodos de control de insectos tradicionales. No obstante, estas proteínas insecticidas de Bt solamente protegen a las plantas de una gama relativamente reducida de plagas. Por otra parte, estos modos de actividad insecticida proporcionaron niveles variables de especificidad y, en algunos casos, ocasionaron consecuencias medioambientales significativas. De este modo, existe una necesidad inmediata de métodos alternativos para el control de plagas.

Breve resumen de la invención Se proporcionan métodos y composiciones que emplean un elemento silenciador que, cuando es ingerido por una plaga, tal como una plaga del orden Lepidoptera, es capaz de disminuir la expresión de una secuencia diana en la plaga. En realizaciones específicas, la disminución de la expresión de la secuencia diana controla la plaga y de ese modo los métodos y las composiciones son capaces de limitar el daño a una planta. La presente invención se refiere a diferentes polinucleótidos diana que codifican polipéptidos de familias específicas como las descritas en alguna parte de la presente memoria y diferentes polinucleótidos diana expuestos en el SEQ ID NO: 1, o variantes o fragmentos activos del mismo, en donde una disminución en la expresión de una o más de las secuencias en la plaga diana controla la plaga (esto es, tiene actividad insecticida) . Los elementos silenciadores, cuando son ingeridos por la plaga, disminuyen el nivel de expresión de uno o más de los polinucleótidos diana. El elemento silenciador comprende al menos 20, o 22 nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1. En realizaciones específicas, la plaga que es controlada es Spodoptera frugiperda. También se proporcionan plantas, partes de plantas, células vegetales, bacterias y otras células anfitrionas que comprenden los elementos silenciadores o una variante o un fragmento activos del mismo.

Por consiguiente, la invención proporciona una célula vegetal que tiene incorporado establemente a su genoma un polinucleótido heterólogo que comprende un elemento silenciador conectado operablemente a un promotor activo en dicha célula vegetal, en donde dicho elemento silenciador comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1,

en donde dicho elemento silenciador, cuando es ingerido por una plaga del orden Lepidoptera, reduce el nivel de una secuencia diana en dicha plaga a menos de 95% del nivel de la secuencia diana en una plaga de control que no ha ingerido el elemento silenciador y de ese modo controla la plaga del orden Lepidoptera.

En otra realización, se proporciona un método para el control de plagas, tal como una plaga del orden Lepidoptera. El método comprende alimentar a una plaga con una composición que comprende un elemento silenciador, en donde el elemento silenciador, cuando es ingerido por la plaga, reduce el nivel de una secuencia diana en la plaga y de ese modo controla la plaga. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para controlar Lepidópteros que comprende alimentar a un Lepidóptero con una composición que comprende un elemento silenciador, en donde dicho elemento silenciador, cuando es ingerido por dichos Lepidópteros, reduce el nivel de una secuencia diana de Lepidópteros a menos de 95% del nivel de la secuencia diana en una plaga de control que no ha ingerido el elemento silenciador y de ese modo controla los Lepidópteros y dicho elemento silenciador comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1.

Los métodos para proteger a una planta de una plaga comprenden la introducción en la planta o parte de la planta de un elemento silenciador. Cuando la planta que expresa el elemento silenciador es ingerida por la plaga, el nivel de la secuencia diana disminuye y la plaga se controla.

Descripción detallada de la invención A continuación se describirán las presentes invenciones más completamente con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran algunas, pero no todas las realizaciones de las invenciones. En efecto, estas invenciones se pueden plasmar en muchas formas diferentes y no se deben considerar limitadas a las realizaciones mostradas en la presente memoria; en lugar de eso, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta descripción satisfaga los requerimientos legales aplicables. Los números similares hacen referencia a elementos completamente similares.

Muchas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones mostradas en la presente memoria acudirán a la mente de los expertos en la técnica a la cual pertenecen estas invenciones que tienen la ventaja de las ilustraciones presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se debe entender que las invenciones no están limitadas a las realizaciones específicas descritas y que las modificaciones y otras realizaciones están destinadas a estar incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque en la presente memoria se emplean términos específicos, estos se utilizan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no con el propósito de limitar.

I. Visión general

Se proporcionan métodos y composiciones que emplean un elemento silenciador que, cuando es ingerido por una plaga, tal como una plaga del orden Lepidoptera, es capaz de disminuir la expresión de una secuencia diana en la plaga. En realizaciones específicas, la disminución de la expresión de la secuencia diana controla la plaga y de ese modo los métodos y las composiciones son capaces de limitar el daño de una planta o parte de una planta. La presente invención proporciona polinucleótidos diana que codifican polipéptidos de hormonas juveniles. El polinucleótido diana se expone en el SEQ ID NO: 1 o variantes y fragmentos activos del mismo. Los elementos silenciadores se diseñan a la vista de estos polinucleótidos diana descritos que, cuando son ingeridos por la plaga, disminuyen la expresión de una o más de las secuencias diana y de ese modo controlan la plaga (esto es, tiene actividad insecticida) . Véanse, por ejemplo, los SEQ ID NO: 51-59.

Según se utiliza en la presente memoria, por "controlar una plaga" o "controla una plaga" se entiende cualquier efecto sobre una plaga que da como resultado la limitación del daño que ocasiona la plaga. Controlar una plaga incluye, pero no está limitado a, eliminar la plaga, inhibir el desarrollo de la plaga, alterar la fertilidad o el crecimiento de la plaga de tal manera que la plaga proporcione menos daño a la planta, disminuir el número de vástagos producidos, producir plagas menos activas, producir plagas más susceptibles del ataque de un depredador, o disuadir a las plagas de ingerir la planta.

Por "resistencia a una enfermedad" se entiende que las plantas evitan los síntomas de la enfermedad que son el resultado de las interacciones entre planta y patógeno. Esto es, se evita que los patógenos ocasionen enfermedades de... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un polinucleótido heterólogo que comprende un elemento silenciador conectado operablemente a un promotor activo en dicha célula vegetal, en donde dicho elemento silenciador comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1,

en donde dicho elemento silenciador, cuando es ingerido por una plaga del orden Lepidoptera, reduce el nivel de una secuencia diana en dicha plaga a menos de 80% del nivel de la secuencia diana en una plaga de control que no ha ingerido el elemento silenciador y de ese modo controla la plaga del orden Lepidoptera.

2. Un método para controlar Lepidópteros que comprende alimentar a un Lepidóptero con una composición que comprende un elemento silenciador, en donde dicho elemento silenciador, cuando es ingerido por dicho Lepidóptero, reduce el nivel de una secuencia diana de Lepidóptero a menos de 80% del nivel de la secuencia diana en una plaga de control que no ha ingerido el elemento silenciador y de ese modo controla el Lepidóptero y dicho elemento silenciador comprende un fragmento de al menos 20 nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el nivel de la secuencia diana se reduce a menos de 50% del nivel de la secuencia diana en la plaga de control.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde dicha composición comprende una planta o parte de planta que tiene incorporado establemente en su genoma un polinucleótido que comprende dicho elemento silenciador.

5. La célula vegetal de la reivindicación 1 o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicha plaga comprende Spodoptera frugiperda.

6. La célula vegetal de la reivindicación 1 o 5, en donde dicho elemento silenciador comprende:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia efectora o antisentido de la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 51, 54, o 57;

b) un polinucleótido que comprende la secuencia efectora o antisentido de una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 51, 54, o 57;

c) un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, o 59; o d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, o 59.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde dicho elemento silenciador comprende:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia efectora o antisentido de la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 51, 54, o 57;

b) un polinucleótido que comprende la secuencia efectora o antisentido de una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 51, 54, o 57;

c) un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, o 59; o d) un polinucleótido que comprende la secuencia mostrada en los SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, o 59.

8. La célula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6 o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o 7, en donde dicho elemento silenciador es transcrito a un ARN en horquilla.

9. La célula vegetal de la reivindicación 8, en donde dicho polinucleótido que comprende el elemento silenciador comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento, y un tercer segmento, en donde:

a) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos que tienen al menos 90% de complementariedad de secuencia con una secuencia diana mostrada en el SEQ ID NO: 1;

b) dicho segundo segmento comprende un bucle de longitud suficiente para permitir que el elemento silenciador sea transcrito a un ARN en horquilla; y,

c) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos que tienen al menos 85% de complementariedad con el primer segmento.

10. El método de la reivindicación 8, en donde dicho polinucleótido que comprende el elemento silenciador comprende, en el siguiente orden, un primer segmento, un segundo segmento, y un tercer segmento, en donde:

a) dicho primer segmento comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos que tienen al menos 90% de

complementariedad de secuencia con el polinucleótido diana mostrado en el SEQ ID NO 1;

b) dicho segundo segmento comprende un bucle de longitud suficiente para permitir que el elemento silenciador sea transcrito en forma de un ARN en horquilla; y,

c) dicho tercer segmento comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos que tienen al menos 85% de complementariedad con el primer segmento.

11. La célula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 6, 8 o 9, en donde dicha célula vegetal, planta o parte de planta tienen incorporado establemente en su genoma un segundo polinucleótido que comprende un elemento intensificador del supresor que comprende la secuencia de la plaga diana o un fragmento o variante activos de la misma, en donde la expresión combinada del elemento silenciador y el elemento intensificador del supresor incrementa la concentración de un ARNi inhibidor específico para la secuencia diana de la plaga en dicha célula vegetal.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, 7, 8 o 10, en donde dicha célula vegetal, planta o parte de planta tienen incorporado establemente en su genoma un segundo polinucleótido que comprende un elemento intensificador del supresor que comprende la secuencia de la plaga diana o un fragmento o variante activos del mismo, en donde la expresión combinada del elemento silenciador y el elemento intensificador del supresor incrementa la concentración de un ARNi inhibidor específico para la secuencia diana de la plaga en dicha célula vegetal.

13. La célula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 6, 8, 9 u 11, en donde:

a) dicha célula vegetal es de una monocotiledónea o dicha planta es una monocotiledónea, y opcionalmente dicha monocotiledónea es maíz, cebada, mijo, trigo o arroz; o b) dicha célula vegetal es de una dicotiledónea, o dicha planta es una dicotiledónea, y en donde opcionalmente dicha dicotiledónea es soja, canola, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis, o algodón.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, 7, 8, 10 o 12, en donde:

a) dicha célula vegetal es de una monocotiledónea o dicha planta es una monocotiledónea, y opcionalmente dicha monocotiledónea es maíz, cebada, mijo, trigo o arroz; o b) dicha célula vegetal es de una dicotiledónea, o dicha planta es una dicotiledónea, y en donde opcionalmente dicha dicotiledónea es soja, canola, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis, o algodón.

15. Una planta o parte de planta que comprende una célula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 6, 8, 9, 11 o 13.

16. La planta o parte de planta de la reivindicación 15, en donde la expresión combinada de dicho elemento silenciador y el elemento intensificador del supresor conectado operablemente a un promotor específico del floema incrementa la concentración de un ARN inhibidor específico para la secuencia diana de la plaga en el floema de dicha planta o parte de planta.

17. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 15 o 16.