Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización.

Molécula de ácido nucleico purificada, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencianucleotídica que codifica para

i) el alérgeno Dac g cuya secuencia en aminoácidos está representada con el número SEC ID nº 2 en ellistado de secuencias adjunto;

o

ii) una de las isoformas maduras del alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos se selecciona de entrelas secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, del listado de secuencias adjunto, o un derivadofuncional y/o inmunológico de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 adjunta, y capaz de unirse a unos anticuerposanti-Dac g5.

Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización.

La presente invención tiene por objeto la clonación y la secuenciación de alérgenos de polen de Dactylis glomerata y más particularmente del alérgeno Dac g5. La presente invención tiene asimismo por objeto la producción de este alérgeno recombinante para ser incorporado en preparaciones útiles para el diagnóstico o el tratamiento de las alergias.

Los alérgenos son las proteínas más abundantes del polen y constituyen la causa principal de alergias en los climas templados. El alérgeno objeto de la presente invención es Dac g5 del polen de Dactylis glomerata.

Ciertos individuos predispuestos genéticamente se vuelven hipersensibles (alérgicos) a unos antígenos que proceden de fuentes medioambientales muy variadas. Los antígenos capaces de inducir una reacción de hipersensibilización inmediata o retardada se denominan alérgenos. Los alérgenos pueden en particular tener su origen en los árboles, las plantas herbáceas, los insectos, los mamíferos, la comida, los medicamentos o productos químicos. Los alérgenos se clasifican en grupos I a V según sus propiedades inmunoquímicas. El alérgeno Dac G5 de Dactylis glomerata pertenece al grupo V, como el alérgeno Lol pV de Lolium perenne.

Los anticuerpos implicados en la alergia pertenecen a la clase de las inmunoglobulinas de tipo IgE. En presencia de un alérgeno, las IgE se unen a los mastocitos y a los basófilos, lo cual conduce a la liberación por estas células de diferentes mediadores químicos y a la manifestación de la alergia.

Ésta puede adoptar diferentes formas, como por ejemplo un choque anafiláctico, asma, rinitis o dermatitis atópica.

Cuando se ha establecido el diagnóstico de la alergia a un compuesto particular, la desensibilización del paciente frente al alérgeno implicado es el enfoque terapéutico más frecuente, en particular cuando no se puede evitar la presencia del alérgeno, como en el caso del polen y de los ácaros. Este tipo de tratamiento ha demostrado su eficacia, pero es necesario disponer de un producto eficaz y seguro. En efecto, el tratamiento presenta un riesgo de choque anafiláctico, además, el producto administrado debe estar desprovisto de cualquier impureza que pudiera constituir otro alérgeno potencial. Ahora bien, hoy en día, sólo se utilizan unas mezclas complejas de alérgenos y sin productos puros. Por lo tanto, es necesario poder disponer de alérgenos con una forma estructural lo más parecida posible al alérgeno nativo, y que presente el mayor grado de pureza posible.

Uno de los medios posibles para alcanzar este objetivo es la producción de alérgenos recombinantes en un organismo hospedante (Laffer, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., Septiembre 1996, volumen 98, nº 3, páginas 652658) .

A título de ejemplos, se pueden citar la solicitud de patente publicada con el nº 819 763, que describe la producción de alérgeno Der fII modificado. La patente europea publicada con el nº 406 286 describe la clonación de un alérgeno principal del polen de la cizaña, Lol p1, y la expresión de este gen. La solicitud de patente publicada con el nº 473 111 se refiere asimismo a la producción de alérgenos de ácaros recombinantes utilizados para la desensibilización. La solicitud de patente publicada con el nº 463 059 se refiere a alérgenos derivados de la ambrosía y la utilización de estas proteínas. Estos documentos presentan la expresión de los genes y la producción de las proteínas en E. coli.

Este sistema de expresión adolece del inconveniente de no asegurar las modificaciones post-traduccionales de las proteínas que se pueden realizar en las células eucariotas. Por ejemplo, las proteínas producidas no están glicosiladas, ahora bien, la glicosilación de ciertas proteínas alérgenas puede ser importante para su capacidad de fijación a las IgE (Van Ree et al., J. Biol. Chem., 2000, volumen 275, páginas 11451-11458) .

La presente invención se refiere a la clonación, a la secuenciación y a la preparación de una molécula de ácido nucleico purificada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína que constituye el alérgeno Dac G5 o un derivado de ésta. La presente invención se refiere asimismo a la inserción de este ácido nucleico en un vector de expresión y a la producción de la proteína recombinante en un organismo o microorganismo hospedante, en particular en unas células vegetales y unas plantas, o parte de plantas, y preferentemente en unas suspensiones celulares y plantas de tabaco. Este alérgeno se produce para su utilización en diagnóstico e inmunoterapia.

La producción de los alérgenos en unas células vegetales, como por ejemplo el tabaco, presenta la ventaja de permitir la producción de proteínas recombinantes glicosiladas. Este medio de producción no se ha utilizado jamás hasta ahora para la producción de alérgenos.

Los trabajos realizados en el marco de la presente invención se han referido:

-a la clonación del ADNc de Dac g5,

- a la inserción de la molécula de ácido nucleico clonada en un vector de expresión apropiado,

- a la producción de Dac g5 recombinante en unos sistemas biológicos,

- a los ensayos inmunológicos del alérgeno purificado.

Dac g5 es una proteína de 26, 5 kDa, de 265 aminoácidos, reconocida por lo menos por el 90% de los sujetos alérgicos al polen de gramíneas.

El alérgeno Dac g5 de Dactylis glomerata pertenece a los alérgenos del grupo V. Se han descrito unas secuencias nucleotídicas que codifican para los alérgenos homólogos a Dac g5 en la técnica anterior (WO 95/06728) . Los inventores han definido unos oligonucleótidos degenerados a partir de estas secuencias, con el fin de amplificar específicamente mediante la técnica de RT-PCR un ADNc que codifica Dac g5. Un fragmento de ADNc de tamaño esperado se clonó a partir de una población de ARN totales de polen de Dactylis glomerata y después se secuenció. Este fragmento se utilizó para definir unos cebadores específicos para los protocolos 5' y 3' RACE-PCR. Estos protocolos han permitido completar los extremos 5' y 3' del fragmento. Después de la amplificación de los extremos 5' y 3', se secuenció el ADNc completo que codifica para Dac g5.

Las secuencias obtenidas han permitido definir nuevos cebadores específicos de Dac g5, estos cebadores se han utilizado para clonar el ADNc de la pro-forma y de la forma madura del alérgeno. Las secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizadas para las reacciones de PCR son las siguientes:

- cebador sentido (pro-forma) , representado en la figura 2A (cebador Cl) y con el número SEC ID nº 9 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG TCT AGA ATG GCG GTC CAG AAG TAC ACC 3'

- cebador antisentido, utilizado para clonar la pro-forma, representado en la figura 2A (cebador F1) y con el número SEC ID nº 10 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG GAG CTC TCA GAC TTT GTA GCC ACC GGC 3'

- cebador sentido (forma madura) , representado en la figura 2A (cebador F2) y con el número SEC ID nº 11 en el listado de secuencias adjunto:

5'AAG CTC GAG AAA AGA GCC GAC GCC GGC TAC ACC 3'

- cebador antisentido, utilizado para clonar la forma madura, representado en la figura 2A (cebador R2) y con el número SEC ID nº 12 en el listado de secuencias adjunto:

5'GGG GGC GGC CGC TCA GAC TTT GTA GCC ACC GGC 3'

Se han secuenciado los clones ADNc, se ha determinado la secuencia en aminoácidos que corresponde a cada secuencia nucleotídica.

Los inventores por lo tanto han conseguido ahora clonar y secuenciar el ácido nucleico que codifica para el alérgeno Dac g5 del polen de Dactylis glomerata. En consecuencia, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico purificada constituida por, o que comprende, una secuencia nucleotídica que codifica para el alérgeno Dac g5 o un derivado de ésta. La secuencia en aminoácido de la pro-forma del alérgeno Dac g5 está representada en la figura 1 y con el número SEC ID nº 2 en el listado de secuencias adjunto. Un fragmento de esta secuencia, delimitado por los aminoácidos en posición 25 a 290, constituye la proteína madura Dac g5. La secuencia en aminoácido de la forma madura del alérgeno Dac g5 está representada en la figura 1 y con el número SEC ID nº 4 en el listado de secuencias adjunto.

La figura 1 adjunta da la secuencia nucleotídica y peptídica de la pro-forma del alérgeno Dac g5 (isoforma 1) . La secuencia subrayada corresponde a la secuencia señal ausente de la proteína madura. Los codones y los aminoácidos que difieren en la isoforma 2 están... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico purificada, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica que codifica para i) el alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos está representada con el número SEC ID nº 2 en el listado de secuencias adjunto; o ii) una de las isoformas maduras del alérgeno Dac g5 cuya secuencia en aminoácidos se selecciona de entre las secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, del listado de secuencias adjunto, o un derivado funcional y/o inmunológico de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al 90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 adjunta, y capaz de unirse a unos anticuerpos anti-Dac g5.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5 o SEC ID nº 7 del listado de secuencias adjunto.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, un promotor unido de manera funcional a dicha molécula de ácido nucleico, eventualmente un gen de selección colocado bajo el control de su propio promotor o del mismo promotor que dicha molécula de ácido nucleico, y ventajosamente una secuencia de terminación colocada aguas abajo de dicha molécula de ácido nucleico.

4. Vector de expresión, caracterizado porque comprende un origen de replicación eucariota o procariota, una secuencia promotora adaptada, un marcador de selección y una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de dichas secuencias de regulación.

5. Hospedante eucariota no humano o procariota transformado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, o por un vector de expresión según la reivindicación 4.

6. Hospedante según la reivindicación 5, caracterizado porque está constituido por una célula vegetal en cuyo genoma se incorpora, ventajosamente de manera estable, una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Planta y muy preferentemente planta de tabaco, que ha incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que el alérgeno Dac g5 se exprese en una parte determinada de la planta.

8. Suspensión celular, muy particularmente de tabaco, cuyas células han incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que el alérgeno Dac g5 se exprese en dichas células.

9. Levadura que ha incorporado de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, colocada bajo el control de una secuencia de regulación de manera que se exprese el alérgeno Dac g5.

10. Procedimiento de obtención de la proteína Dac g5 recombinante, de una isoforma o de un derivado funcional o inmunológico de ésta, tales como se han definido en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo, procariota o eucariota, transformado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3,

o por un vector de expresión según la reivindicación 4, en unas condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de dicha proteína, y después el aislamiento de las proteínas producidas a partir del cultivo de los organismos transformados.

11. Proteína recombinante que comprende o que está constituida por el alérgeno Dac g5 de secuencia SEC ID nº 2, una isoforma de éste de secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 8, o un derivado de éste que presenta una homología de secuencias de aminoácidos superior al 90% con la secuencia presentada con el número SEC ID nº 2 y capaz de unirse a unos anticuerpos anti-Dac g5.

12. Composición farmacéutica para el tratamiento o el diagnóstico de una alergia, caracterizada porque comprende como principio activo una cantidad eficaz de una proteína según la reivindicación 11 o de un anticuerpo obtenido mediante inmunización de un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína.

13. Procedimiento in vitro de detección de la sensibilidad manifestada por un individuo al polen de herbáceas y en particular al polen de Dactylis glomerata, caracterizado porque comprende la puesta en contacto de una muestra que procede de un individuo con la proteína según la reivindicación 11 o un anticuerpo obtenido por inmunización de

un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína, en unas condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo, y después la detección de dicho complejo.

14. Agente reactivo de diagnóstico de una alergia, caracterizado porque comprende una proteína según la reivindicación 11 o un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con esta proteína y dirigido contra esta proteína.