Cepa de células que pueden cultivarse sin componentes de origen animal, procedimiento para su producción, procedimiento de producción de virus usando dicha cepa y procedimiento de producción de una vacuna.

Una cepa de células, en la que la cepa incluye una cepa de células depositada con el número de accesoFERM BP-10225.

Cepa de células que puede cultivarse sin componentes de origen animal, procedimiento para su producción, procedimiento de producción de virus usando dicha cepa y procedimiento de producción de una vacuna

Campo técnico

La presente invención se refiere a una cepa de células que puede cultivarse sin componentes de origenanimal y un procedimiento para su producción. Además, la presente invención también se refiere a un procedimientopara producir un virus usando la cepa de células anterior.

Antecedentes de la técnica Ha pasado más de medio siglo desde la creación de una técnica para el cultivo de células animales y similares en un tubo de ensayo. Esta técnica se ha desarrollado significativamente junto con la progresión de laciencia y la tecnología

En general, cuando se usa directamente un animal vivo para experimentación, los resultados pueden entenderse fácilmente. Sin embargo, esta exploración directa de un animal vivo ha sido problemática tanto técnicacomo económicamente. Por tanto, se ha escindido una porción del animal y se han replicado las células de dichaporción en un entorno artificial, como una placa de Petri o un tubo de ensayo. Este procedimiento se denominaprocedimiento de cultivo tisular o procedimiento de cultivo celular. Puesto que esta técnica no ha resultado difícil, hasido posible producir productos farmacéuticos, vacunas, antígenos de diagnóstico, etc., mediante este procedimiento. Sin embargo, para cultivar células animales in vitro, es necesario cultivar las células prácticamente en las mismas condiciones que las condiciones originales in vivo. Por ejemplo, se aplican condiciones, tales como unlugar aséptico o un entorno de temperatura que se establece a la misma temperatura de un organismo vivo.

Además, incluso si se han satisfecho las condiciones mencionadas anteriormente, ha sido necesario para ladivisión celular y la replicación suministrar adicionalmente un «factor de crecimiento celular» como nutriente. Entrelos ejemplos de estos factores de crecimiento celular se incluyen diversos tipos de hormonas, insulina, putrescina y un factor de crecimiento de fibroblasto. Sin embargo, estos factores de crecimiento celular no se han aclaradotodavía en todas las especies celulares y se incluyen, en muchos casos, componentes desconocidos.

Por tanto, en lugar de factores de crecimiento celular, pueden usarse sueros de animales. Los efectos deestos no pueden preverse de forma específica. Entre estos sueros de animales se selecciona normalmente un suerobovino debido a la gran población bovina y también porque puede suministrarse de forma estable. Especialmente, seha usado con frecuencia suero fetal bovino porque contiene sólo una pequeña cantidad de proteína tóxica. Enestudios científicos se dan casos en los que un material de ensayo puede contener una proteína de origen bovino, aunque ésta no sea la especie animal de interés. Sin embargo, el uso de esta proteína de origen bovino comoproducto farmacéutico para humanos u otras especies animales puede producir problemas.

El primer problema está relacionado con la alergia. Cuando se inyecta por vía parenteral una vacuna o unfármaco que contiene suero bovino a un humano, o a animales, puede que la primera inyección no cause problemas en muchos casos. Sin embargo, una segunda inyección o inyecciones posteriores pueden causar un problemareferente a una reacción alérgica. Este fenómeno puede explicarse desde un punto de vista inmunológico. Es decir, un animal sólo reacciona ligeramente con una sustancia de alto peso molecular (p. ej., una proteína que tiene unpeso molecular de 10.000 daltons o superior) cuando el animal se ve expuesto a la sustancia por primera vez y, portanto, la sustancia administrada se metaboliza in vivo. Sin embargo, permanece en el sistema inmune una memoriareferente a la exposición. Por tanto, cuando el animal se expone a la sustancia (antígeno) por segunda vez oposterior, las células del sistema inmune que memorizaron la primera exposición reaccionan directamente con lasustancia y, como resultado, se produce una reacción vital que es más fuerte que la de la primera exposición enmenos tiempo. Dependiendo de los tipos de seres humanos o animales, pueden darse casos en los que se produzcauna reacción desfavorable con un antígeno al que se ve expuesto desde el exterior. Típicamente, esta reacción sedenomina reacción alérgica. Esta reacción alérgica produce fiebre o hinchazón en el sitio de inyección y, en el peorde los casos, los seres humanos o animales mueren por disnea debido a obstrucción respiratoria, colapso y similares.

El segundo problema se refiere a la contaminación de patógenos o anticuerpos de suero bovino en dichosuero bovino. Un ejemplo famoso es la contaminación con pestivirus, retrovirus, micoplasma, etc., de origen bovino.Recientemente, el prión, que es el patógeno de la encefalopatía espongiforme bovino (EEB) conocida como la enfermedad de las vacas locas, se ha convertido en un posible problema.

Como se estableció anteriormente, aunque el uso de suero bovino puede dar lugar ocasionalmente a laaparición de problemas, dicho suero bovino se ha usado frecuentemente para la producción de vacunas utilizadasespecialmente en el campo veterinario dirigidas a animales en todo el mundo.

Sin embargo, se han divulgado una tentativa de no usar suero bovino en el procedimiento de cultivo celular (un medio sin suero (MSS) y un procedimiento de cultivo celular sin suero) y la producción de una vacuna experimental para bóvidos usando dicho medio sin suero y dicho procedimiento de cultivo celular sin suero (Makoschey y col., Serum-free produced bovine herpesvirus type 1 an bovine parainfluenza type 3 virus vaccines areefficacious and safe. Cytotechnology, 39: 139-145, 2002) . Sin embargo, en la publicación no se describen vacunas utilizadas para animales distintos a bóvidos. Además, tampoco se describen en absoluto vacunas utilizadas en perros.

Además, se ha publicado que las células MDCK han sido cultivadas en un medio sin suero y que, acontinuación, se ha replicado el virus de la gripe (Kessler y col., Suitability of MDCK cells grown in a serum-free medium for influenza virus production. En Brown y col., ed., Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 1999, vol. 98, pag., 13-21: Merten y col., Production of influenza virus in serum-freemammalian cell cultures. En Brown y col., ed. Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol.Stand. Basel, Karger, 1999, vol. 98, pág. 27.37: Voten y col., Generation and characterization of reassortant

influenza A viruses propagated in serum-free cultured MDCK-SF1 cells. En Brown y col., ed., Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 1999, vol. 98; pág. 77-87: Voeten y col., Characterization of high-grown reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-freemedium. Vaccine 17:1942-1950, 1999. Keiichi Makisumi y col., Cells that can be used in serum free culture and suspension culture and method of producing viruses used for vaccines using such cells; publicación local de lapublicación internacional PCT para solicitud de patente (A1) , publicación internacional WO01/064846; fecha depublicación internacional: 07/09/2001) . Sin embargo, los medios descritos en estas publicaciones comprendíancomponentes desconocidos o, aunque no contenían suero, comprendían componentes de origen animal.

Se han divulgado un procedimiento de crioconservación sencillo de cultivos celulares en un medio sin suero, un procedimiento que comprende añadir dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % al medio MDSS2 (AXCELL

Biotechnologies, F-69610 Saint Genis l'Arentiere) que es un tipo de MSS y, a continuación, se crioconservan células Vero como células derivadas de riñón de mono y células BHK-21 como células derivadas de riñón de hámsterusando el medio producido (Merten y col., A simple serum-free freezing medium for serum-free cultured cells.Biologicals, 23: 185-189, 1995) . Sin embargo, dicho medio MDSS2 contiene peptona al 0, 3 % derivada de caseínacomo proteína animal. Además, también se ha publicado que un medio producido por la adición del 10 % de DMSOa un medio sin suero para producción de virus (MSS-PV) puede aplicarse a la crioconservación de células que se hacultivado en un medio sin suero (Price y Evege, Serum-free medium without animal components for virus production.Focus, 19: 67-69, 1997) . Sin embargo, la composición del MSS-PV en sí sigue siendo desconocida.

Por tanto, ha sido deseable el desarrollo de un medio que no contenga componentes de origen animal, células cultivadas en un medio que no contenga componentes de origen animal, vacunas seguras,... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de células, en la que la cepa incluye una cepa de células depositada con el número de acceso FERM BP-10225.

2. Un procedimiento in vitro de producción de un virus, que comprende: infectar la cepa de células según la5 reivindicación 1 con un virus y cultivar la cepa de células infectada para que el virus se replique.

3. El procedimiento de producción de un virus según la reivindicación 2, en el que el medio utilizado para elcultivo de la cepa de células infectada comprende medio RPMI 1640 y una peptona derivada de soja pero nocomprende componentes de origen animal.

4. El procedimiento de producción de un virus según la reivindicación 2, en el que el cultivo de la cepa de10 células infectada se realiza mediante un procedimiento de cultivo en suspensión.

5. El procedimiento de producción de un virus según la reivindicación 2, en el que el virus se selecciona entre el grupo compuesto por Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Flaviviridae, Caliciviridae, Adenoviridae, Herpesviridae y Parvoviridae.

6. El procedimiento de producción de un virus según la reivindicación 2, en el que el virus se selecciona entre

el grupo compuesto por el virus del moquillo canino, virus del sarampión, virus de la parainfluenza canina, virus SV5, virus de la gripe, virus de la rabia, virus de la encefalitis japonesa, calicivirus canino, adenovirus caninos de tipo 1 y tipo 2, adenovirus humano, herpesvirus canino y parvovirus caninos de tipo 1 y tipo 2.