Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

Una célula que produce de forma estable a partir de ácido o ácidos nucleicos integrados en su genoma al menosuna ARN polimerasa,

una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada yuna fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales delos mismos, en el que dicho ácido o ácidos nucleicos es al menos una copia de un ácido nucleico que codifica unaARN polimerasa, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N, al menos una copia de unácido o ácidos nucleicos que codifican una proteína P y al menos una copia de un ADN solapado asociadofuncionalmente con el ácido o ácidos nucleicos que codifican estas al menos ARN polimerasa, nucleoproteína (N) yfosfoproteína (P) o derivados funcionales de los mismos, y en el que dichos derivados funcionales de la ARNpolimerasa y/o nucleoproteína (N) y/o fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa y/o de laproteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como uncomplejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, enun sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada apartir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo queconsiste en:

a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtrosde nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación del 50% deformamida, 6X SSC a 42º C y condiciones de lavado a 68º C, 0,2X SSC y el 0,1% de SDS) con un ácidonucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, la proteína N y la proteína P de una cepa o virusde ARN de cadena de sentido negativo no segmentada;

b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80%, preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%o incluso el 99% de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, laproteína N o la proteína P, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambassecuencias; y

c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, laproteína N o la proteína P en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa,preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido,preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido;

o siendo un fragmento que representa al menos el 70%, particularmente el 80% y más particularmente el 90% oincluso el 95% de la ARN polimerasa de longitud completa, proteína N o proteína P.

Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada La presente invención se refiere a células recombinantes así como también a métodos para la generación de virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada (NNV o mononegavirales) a partir de ácido desoxirribonucleico clonado (ADNc) , especialmente a partir del virus de sarampión y en particular a partir de cepas atenuadas tales como las aprobadas para la vacunación, en particular a partir del virus de sarampión atenuado Schwarz y varios virus en base a sarampión Schwarz recombinantes que expresan secuencias heterólogas. Tales virus de rescate pueden utilizarse, después de la amplificación, como vacunas para inmunización en contra de sarampión y/o en contra de péptidos heterólogos o proteínas expresadas.

Los virus de ARN atenuados vivos hacen vacunas muy eficaces. Entre éstas, la vacuna de sarampión se ha utilizado en cientos de millones de niños y se ha probado que es eficaz y segura. Esta vacuna induce inmunidad de por vida 15 después de una o dos inyecciones. La misma se produce fácilmente a gran escala a bajos precios en la mayoría de los países. Estas ventajas hacen al virus de sarampión, especialmente cepas de vacuna atenuadas, un buen vector candidato para inmunizar niños pero incluso en algunas circunstancias las poblaciones adultas, frente a sarampión y/o patologías infecciosas, especialmente patologías virales tales como SIDA (retrovirus) , enfermedades de flavivirus o coronavirus (SARS) .

Los virus de sarampión atenuados se han utilizado como vacunas desde la década de 1960 puesto que es una de las vacunas humanas más eficaces y seguras. Las campañas de vacunación han sido muy eficaces para controlar el sarampión en los países desarrollados. Sin embargo, debido a la distribución inadecuada de la vacuna en los países en desarrollo, el sarampión aún infecta a aproximadamente 45 millones de individuos y es responsable de la muerte de 700.000 niños por año. Por lo tanto, la OMS ha incrementado su programa de vacunación global para los próximos 10-20 años (C.D.C., 2005) . Tomando ventaja de las campañas de la OMS, el uso de vectores de vacuna obtenidos a partir de vacuna de sarampión permitirán en algunas regiones del mundo la inmunización simultánea de niños frente a sarampión y otras enfermedades infecciosas con nuevas vacunas pediátricas multivalentes, especialmente bivalentes que son tanto seguras como eficaces.

El virus de sarampión (MV) pertenece al género Morbillivirus en la familia Paramyxoviridae. Es un virus con envuelta con un genoma de ARN de cadena de polaridad negativa no segmentada (15.894 pb) . El sarampión puede contraerse una vez que el sistema inmune muestra una fuerte respuesta específica y establece una memoria de por vida que protege frente a re-infección. Esta protección se basa tanto en la producción de anticuerpos como de linfocitos T CD8+ citotóxicos de memoria (CTL) . Las cepas patógenas alteran de forma marcada la hematopoyesis (Arneborn y col., 1983; Kim y col., 2002; Okada y col., 2000) dando como resultado, por tanto, inmunosupresión transitoria responsable de la mayoría de las muertes debido a infección por sarampión en los países en desarrollo. Al contrario de las cepas primarias, las cepas atenuadas no inducen la inmunosupresión (Okada y col., 2001) .

La cepa Edmonston de virus de sarampión fue aislada en 1954 mediante cultivo en células primarias humanas (Enders y col., 1954) . La adaptación a fibroblastos embrionarios de pollo produjo semillas de vacuna que se atenuaron adicionalmente mediante pases posteriores en fibroblastos embrionarios de pollo (Schwarz y col., 1962) . Las cepas Schwarz y Moraten que poseen secuencias de nucleótidos idénticas (Park y col., 2001a; Parks y col., 2001b) constituyen la vacuna de sarampión más frecuentemente usada. La vacunación con una o más inyecciones 45 induce la inmunidad de por vida (Griffin y col., 2001; Hilleman y col., 2002) . La persistencia de células CD8 y anticuerpos se ha demostrado hasta 25 años después de la vacunación (Ovsyannikova y col., 2003) . La vacuna contra el sarampión se produce fácilmente a gran escala en la mayoría de los países y puede estar disponible a bajo coste. La atenuación del genoma viral se produce como resultado de una combinación ventajosa de varias mutaciones. Por tanto, la vacuna es muy estable y la reversión de las cepas de vacuna no se ha observado nunca hasta ahora (Hilleman y col., 2002) . Además, el virus se replica solamente en el citoplasma, eliminando cualquier riesgo de integración en los cromosomas del genoma del hospedador. Estas características hacen de las vacunas de sarampión atenuadas vivas un excelente candidato para el desarrollo de un vector de vacuna multivalente. Con este fin, se ha clonado un ADNc infeccioso que corresponde al antigenoma de cepa de MV Edmonston B y se estableció una técnica de genética inversa que posibilita la producción del virus correspondiente (Radecke y col.,

1995) .

Los inventores han desarrollado previamente un vector utilizando Schwarz MV, la vacuna de sarampión más comúnmente utilizada en el mundo (Combredet y col., 2003) . Este vector puede expresar una variedad de genes o combinación de genes grandes para más de 12 pasajes. Se produjeron vectores MV recombinantes que contienen 4.000-5.000 nucleótidos adicionales, que representan un 30% adicional del genoma. Estos virus se produjeron en cultivo celular en títulos comparables con MV convencional. Después de 12 pasajes y un factor amplificador de 1020, más del 96% de las células infectadas continúan expresando los genes adicionales. Esta expresión notablemente estable, observada también para otros miembros de Mononegavirales (Schnell y col., 1996) se debe probablemente a la ausencia de limitaciones geométricas en el tamaño del genoma por estos virus de nucleocápside helicoidal, al 65 contrario de los virus con cápsides icosaédricas. Además, MV infecta células del sistema inmune (macrófagos y células dendríticas) , suministrando de esta manera los antígenos de carga directamente a las células presentadoras de antígeno más eficaces, una ventaja principal para un vector de vacuna. Finalmente, el genoma de MV es pequeño, evitando de esta manera la respuesta al vector que abruma la respuesta a transgénes.

En base a la suposición de que la seguridad y eficacia de una cepa atenuada depende en última instancia de su secuencia del genoma, los inventores han clonado el ADNc infeccioso que corresponde al antigenoma del virus de sarampión Schwarz/Moraten a partir de partículas de virus purificadas a partir de una preparación industrial de la vacuna Schwarz con procedimientos óptimos para mantener la fidelidad (Combredet y col., 2003) . Para optimizar el rendimiento del sistema de genética inversa, el ADNc viral antigenómico se colocó bajo el control del promotor de ARN polimerasa de fago T7 con un motivo GGG adicional requerido para eficacia óptima. Para permitir la escisión exacta del ARN viral, una ribozima cabeza de martillo se insertó entre el motivo GGG y el primer nucleótido viral y la ribozima de virus de hepatitis delta se colocó cadena abajo del último nucleótido viral. El plásmido pTM-MVSchw resultante habilitó la producción del virus correspondiente utilizando un sistema de genética inversa anteriormente descrita en base a la transfección de células auxiliares humanas (Radecke y col., 1995) . Para prevenir la adaptación de la vacuna recombinante a células no certificadas, las células auxiliares transfectadas con ADNc se co-cultivaron con fibroblastos embrionarios de pollo, las células en las cuales los virus se seleccionaron originalmente y en las cuales se producen actualmente. Después de varios pasajes del virus recombinante, se observó que la secuencia de su genoma entero era idéntica a la secuencia original (Combredet y col., 2003) . La inmunogenicidad del virus rescatado del plásmido pTM-MVSchw se evaluó en ratones y macacos transgénicos y se comparó con la vacuna Schwarz fabricada a nivel industrial. Todos los macacos vacunados desarrollaron anticuerpos anti-MV y respuestas celulares específicas. No se observaron diferencias entre el virus Schwarz producido a partir de ADNc y la vacuna original, indicando que el virus clonado tuvo la misma inmunogenicidad que la vacuna parental (Combredet y col., 2003) . Este clon molecular permite la producción de vacuna de sarampión Schwarz sin depender de las reservas de semillas.

El plásmido pTM-MVSchw se modificó para la expresión en genes extraños mediante la introducción de unidades transcripcionales (ATU) en diferentes posiciones del genoma. Estas ATU son casetes de sitio de multiclonación insertados por ejemplo en una... [Seguir leyendo]

1. Una célula que produce de forma estable a partir de ácido o ácidos nucleicos integrados en su genoma al menos una ARN polimerasa, una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos, en el que dicho ácido o ácidos nucleicos es al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N, al menos una copia de un ácido o ácidos nucleicos que codifican una proteína P y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con el ácido o ácidos nucleicos que codifican estas al menos ARN polimerasa, nucleoproteína (N) y fosfoproteína (P) o derivados funcionales de los mismos, y en el que dichos derivados funcionales de la ARN polimerasa y/o nucleoproteína (N) y/o fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa y/o de la proteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP) , funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0, 5%, EDTA 1, 0 mM (pH 8, 0) , condiciones de hibridación del 50% de formamida, 6X SSC a 42º C y condiciones de lavado a 68º C, 0, 2X SSC y el 0, 1% de SDS) con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, la proteína N y la proteína P de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada; b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80%, preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%

o incluso el 99% de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, la proteína N o la proteína P, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias; y c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de tipo silvestre, la proteína N o la proteína P en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido;

o siendo un fragmento que representa al menos el 70%, particularmente el 80% y más particularmente el 90% o incluso el 95% de la ARN polimerasa de longitud completa, proteína N o proteína P.

2. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la producción estable no se produce como resultado de una selección de fármaco.

3. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende integrado en su genoma:

a. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción,

b. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción, y

c. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción.

4. Una célula que se puede obtener por recombinación de su genoma con:

a. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa,

b. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

c. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

5. Una célula que se puede obtener por recombinación de su genoma con un vector de expresión que comprende:

a. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa.

b. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de sentido negativo no segmentada.

c. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y

d. un ADN solapado.

6. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las proteínas N y P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son del mismo virus.

7. Una célula de acuerdo con la reivindicaciones 6, en la que las proteínas N y P son de la misma cepa de virus o de diferentes cepas de virus.

8. Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en la que las proteínas N y P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son de diferentes virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

9. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las proteínas N y P de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son de un virus MV atenuado, particularmente cepa Schwarz MV.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el promotor es un promotor CMV.

11. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la ARN polimerasa es la ARN polimerasa de fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) .

12. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el ADN solapado se obtiene a partir de un retrovirus.

13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el ADN solapado se obtiene a partir de un lentivirus, particularmente un lentivirus humano.

14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el ADN solapado se obtiene a partir de un virus de VIH, CAEV, EIAV, VISNA, SIV o FIV.

15. Una célula de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el ADN solapado se obtiene a partir de VIH-1 o VIH-2.

16. Una célula de acuerdo con la reivindicación 4 o una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en la que los vectores son:

a. el plásmido HIV-1-TRIP!U3.CMV-T7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3702 o el plásmido HIV-1-TRIP!U3.CMV-nlsT7, depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3703.

b. el plásmido HIV-1-TRIP!U3.CMV-N depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3700, y

c. el plásmido HIV-1-TRIP!U3.CMV-P depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3701.

17. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, la cual es una célula eucariota.

18. Una célula de acuerdo con la reivindicación 17, la cual es una célula de mamífero.

19. Una célula de acuerdo con la reivindicación 18, la cual es una célula humana.

20. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que puede dividirse.

21. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, la cual es una célula HEK 293 (riñón embrionario humano) .

22. Una célula de acuerdo con la reivindicación 21, la cual es una línea de célula.

29. T7-NP depositada en el CNCM el 14 de junio de 2006 con el número I-3618.

23. Una célula de acuerdo con la reivindicación 21, la cual es la línea de célula.

29. nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006, con el número I-3662.

24. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que no se puede dividir.

25. Una célula de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende integrada en su genoma al menos una copia de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, opcionalmente bajo el control de elementos reguladores de trascripción.

26. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, recombinada adicionalmente por un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

27. Una célula de acuerdo con la reivindicación 26, en la que el vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

28. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que las proteínas N, P y L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son del mismo virus.

29. Una célula de acuerdo con la reivindicación 28, en la que las proteínas N, P y L son de la misma cepa de virus o de cepas de virus diferentes.

30. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que las proteínas N, P y L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son de diferentes virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.

31. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, en la que la proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus MV, particularmente de una cepa Schwarz MV.

32. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, recombinada adicionalmente con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada.

33. Una célula de acuerdo con la reivindicación 32, en la que la secuencia de dicho clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada se modifica mediante inserción en lugar o lugares permisivos de ácido o ácidos nucleicos heterólogos.

34. Un cultivo celular que está compuesto de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

33.

35. Un cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 34, el cual es un cultivo primario.

36. Un cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 34, el cual es una línea celular.

37. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula o un cultivo de células que produce de manera estable a partir de ácido o ácidos nucleicos integrados en su genoma una ARN polimerasa, una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína de co-factor de polimerasa (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, en el que dicho ácido o ácidos nucleicos es al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con el ácido o ácidos nucleicos que codifican estas ARN polimerasa, nucleoproteína (N) y fosfoproteína (P) o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada,

b. transferir dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes a células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

c. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b.

38. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa

(L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada,

b. transferencia de dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes a células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y

c. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b.

39. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada y,

b. transferencia de una célula recombinante o cultivo de células recombinantes a células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

c. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b.

40. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que dicho cultivo de células es la línea de célula.

29. T7-NP depositada en el CNCM el 14 de junio de 2006 con el número I-3618 o la línea de célula.

29. nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006, con el número I-3662.

41. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en el que dichas células competentes en la etapa b son células Vero (riñón de mono verde Africano) , células CEF (fibroblastos embrionarios de pollo) o células MRC5.

42. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula o un cultivo de células que produce de manera estable a partir de ácido o ácidos nucleicos integrados en su genoma una ARN polimerasa, una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína de co-factor de polimerasa (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, en el que dicho ácido o ácidos nucleicos es al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con el ácido o ácidos nucleicos que codifican estas ARN polimerasa, nucleoproteína (N) y fosfoproteína (P) o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

b. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de la célula recombinante o cultivo de células recombinantes.

43. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula de cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, con clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

b. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes.

44. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que comprende o consiste en:

a. recombinar una célula o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y

b. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de la célula recombinante o cultivo de células recombinantes.

45. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en el que dicha célula o cultivo de células es un cultivo de células eucariotas, particularmente un cultivo de células de mamífero o un cultivo de células humanas.

46. Método de acuerdo con la reivindicación 45, en el que dicho cultivo celular es fibroblastos humanos, especialmente la línea de células MRC5 (fibroblastos de pulmón humano) .

47. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en la que la secuencia de nucleótidos de dicho clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada se modifica mediante inserción, en lugares permisivos, de al menos un ácido o ácidos nucleicos heterólogos.

48. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 47, en el que dicho ácido nucleico heterólogo codifica epítopos o poliepítopos.

49. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 48, en el que dicho clon de ADNc de cadena

de sentido negativo no segmentada modificado de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus MV atenuado, particularmente la cepa MV Schwarz.

50. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1, en la dichas ARN polimerasa de tipo silvestre, proteína N y

proteína P tienen una secuencia como se define en SEC ID Nº: 9, 13 y 15, respectivamente. 10