Células o plantas que tienen una capacidad productora de polilactato o sus copolímeros, y procedimiento para la preparación de polillactato o sus copolímeros mediante su uso.

Células transformadas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímero de hidroxialcanoatolactato[poli(hidroxialcanoato-co-lactato)],

que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen quecodifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC,

en donde dichas células transformadas se obtienen por transformación de células que no tienen un gen que codificala sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC con un vector recombinante que contiene ungen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionadaentre phaC y phaRBC.

Células o plantas que tienen una capacidad productora de polilactato o sus copolímeros, y procedimiento para la preparación de polilactato o sus copolímeros mediante su uso Campo de la técnica La presente invención se refiere a células o plantas que tienen la capacidad de producir polilactato o sus copolímeros, y un procedimiento para la preparación de polilactato o sus copolímeros mediante su uso, más específicamente, se refiere a células o plantas capaces de expresar un gen que codifica una enzima que convierte el lactato en lactil-CoA y un gen que codifica una enzima que interviene en la síntesis de PHA, y un procedimiento para la preparación de polilactato o copolímero de hidroxialcanoato-lactato, en donde el procedimiento comprende: cultivar las células en un medio que contiene lactato, fuentes de carbono que proporcionan hidroxialcanoil-CoA o lactato y diversos hidroxialcanoatos, o cultivar las plantas.

Antecedentes de la técnica El polilactato (PLA) es un polímero biodegradable típico procedente del lactato, que tiene muy diversas aplicaciones como un polímero médico o habitual. En la actualidad, el PLA se prepara mediante la polimerización del lactato que sintetizan los microorganismos fermentadores, pero sólo se produce PLA de bajo peso molecular (1000 a 5000 Da) mediante la polimerización directa de lactato. Para sintetizar el PLA de alto peso molecular (>100.000 Da) se puede utilizar un procedimiento que polimeriza el PLA de bajo peso molecular obtenido mediante la polimerización directa del lactato mediante un agente de conjugación de cadenas para obtener un PLA de mayor peso molecular. Pero esto tiene desventajas en el sentido de que el proceso de preparación del PLA de alto peso molecular es complicado debido a la adición de un solvente o de un agente de conjugación de cadenas y también en que no resulta fácil retirarlos. En la actualidad, en el proceso para la preparación del PLA de alto peso molecular disponible comercialmente se utiliza un procedimiento en el cual el lactato se convierte en lactida para sintetizar el PLA mediante la ciclodeshidratación del anillo de lactida.

Mientras tanto, el PHA es un poliéster que se acumula en los microorganismos como compuesto de almacenamiento de energía y de carbono cuando faltan otros elementos nutritivos (por ejemplo, fósforo, nitrógeno, magnesio, oxígeno) mientras que la fuente de carbono se encuentra en exceso. Se sabe que el PHA es un material alternativo para la síntesis de los plásticos actuales porque sus propiedades son similares a las de los polímeros sintetizados que derivan del petróleo actual y, al mismo tiempo, presenta una tasa de biodegradación excelente.

El PHA actual se divide en SCL-PHA (por su nombre en inglés, que significa PHA con una longitud de cadena corta) que tiene cadenas de carbono cortas y en MCL-PHA (or su nombre en inglés, que significa PHA con una longitud de cadena media) que tiene cadenas de carbono largas. Se clonó de Ralstonia eutropha, Pseudomonas, un gen que sintetiza PHA y se sintetizó PHA que consiste en varios monómeros mediante microorganismos recombinantes (Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157: 155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167: 89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150: 303, 1997; patente internacional WO 01/55436; patente de los EE.UU US 6.143.952; patente internacional WO 98/54329; patente internacional WO 99/61624) .

Para producir el PHA en los microorganismos se requieren una enzima que convierte los metabolitos de los microorganismos en un monómero de PHA, y la PHA sintasa que sintetiza el polímero de PHA a partir del monómero de PHA. La PHA sintasa sintetiza el PHA a partir del sustrato hidroxiacil-CoA, y se sabe que la ºcetotiolasa (PhaA) , acetoacetil-CoA reductasa (PhaB) clonada de Ralstonia eutropha, etc., la 3-hidroxidecanoil-ACP:CoA transferasa (PhaG) clonada de Pseudomonas, la enoil-CoA hidratasa específica del isómero R (PhaJ) procedente de Aeromonas caviae y Pseudomonas aeruginosa (Fukui et al., J. Bacteriol., 180: 667, 1998; Tsage et al., FEMS Microbiol. Lett., 184; 193, 2000) , 3-cetoacil-ACP reductasa (FabG) procedente de E. coli y Pseudomonas aeruginosa (Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176: 183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182: 2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214: 217, 2002) son enzimas capaces de proporcionar el hidroxiacil-CoA que es sustrato de PHA. Se han sintetizado varias clases de PHA mediante hidroxialcanoatos hidroxilados en distintas posiciones de la cadena de carbonos (principalmente en las posiciones 3, 4, 5, 6) con estas enzimas.

Sin embargo, se ha descrito que tiene poca actividad PHA sintasa sobre los hidroxialcanoatos hidroxilados en la posición 2 (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56: 131, 2001; Valentin y Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40: 699, 1994; Yuan et al., Arch. Biochem. Biophysics; 394: 87, 2001) . Hasta ahora se ha descrito la actividad de la PHA sintasa sobre el lactil-CoA mediante la medición in vitro de la actividad PHA polimerasa en presencia de lactil-CoA, pero hay muy poca actividad PHA sintasa en lactil-CoA (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 131, 2001; Valentin y Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40: 699, 1994) . Es decir, no hay ejemplos de que el PHA y sus copolímeros se produzcan de forma natural o mediante células o plantas recombinantes porque el hidroxialcanoato, tal como el lactato hidroxilado en la posición del carbono 2, no es adecuado para la especificidad de sustrato de la PHA sintasa.

Por lo tanto, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para producir el PLA de alto peso molecular y sus copolímeros mediante células o plantas, y como resultado confirmaron que los copolímeros de poli[hidroxialcanoato-co-lactato] se produjeron al cultivar Ralstonia eutropha recombinante transformada con el gen de la propionil-CoA transferasa (pct) procedente de Clostridium propionicum, que es un gen que codifica una enzima que convierte el lactato en lactil-CoA en un medio de producción que contiene lactato, y el PLA se produjo mediante el cultivo de E. coli recombinante transformada con el gen de la PHA sintasa procedente de Bacillus cereus y el gen pct en un medio de producción que contiene lactato, con lo que se completa la presente invención.

Descripción de la invención El principal objetivo de la presente invención es dar a conocer células transformadas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímero de hidroxialcanoato-lactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], que contienen un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC, en donde dichas células transformadas se obtienen mediante la transformación de las células que no tienen un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC, con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer células transformadas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímero de hidroxialcanoato-lactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC,

en donde dichas células transformadas se obtienen:

por transformación de las células que tienen un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa; o por transformación de las células que tienen un gen que codifica la propionil-CoA transferasa con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para preparar polilactato o sus copolímeros mediante el cultivo de dichas células o plantas.

Para conseguir el objetivo anterior, en un aspecto, la presente invención da a conocer células o plantas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímeros de hidroxialcanoato-lactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], que simultáneamente tienen un gen que codifica una enzima que convierte el lactato en lactil-CoA y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos (PHA) capaz de utilizar el lactil-CoA de sustrato.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para preparar polilactato o copolímeros de hidroxialcanoato-lactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], en donde el procedimiento comprende las... [Seguir leyendo]

1. Células transformadas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímero de hidroxialcanoatolactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC,

en donde dichas células transformadas se obtienen por transformación de células que no tienen un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC.

2. Células transformadas que tienen la capacidad de producir polilactato o copolímero de hidroxialcanoatolactato [poli (hidroxialcanoato-co-lactato) ], que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC,

en donde dichas células transformadas se obtienen:

por transformación de las células que tienen un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la propionil-CoA transferasa; o por transformación de las células que tienen un gen que codifica la propionil-CoA transferasa con un vector recombinante que contiene un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC.

3. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas células están transformadas con un vector recombinante que contiene la propionil-CoA transferasa, al mismo tiempo que está transformada con un vector que contiene phaC o phaRBC, o phaC o phaRBC están insertados en el cromosoma de las mismas.

4. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células que no tienen un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos es E. coli.

5. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichas células que tienen un gen que codifica la propionil-CoA transferasa se amplifican con dicho gen.

6. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichas células que tienen un gen que codifica la propionil-CoA transferasa son de Clostridium propionicum.

7. Procedimiento para preparar polilactato o copolímero de poli (3HB-co-lactato) , en donde el procedimiento comprende: cultivar las células de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio que contiene lactato, o lactato y diferentes tipos de hidroxialcanoato como fuente de carbono; y recuperar el polilactato o el copolímero de poli (3HB-co-lactato) de las células cultivadas.

8. Procedimiento para preparar un copolímero [poli (3HHx-co-3HO-co-3HD-co-lactato) ] y lactato, en donde el procedimiento comprende: cultivar las células de la reivindicación 1 en un medio que contiene lactato y ácido graso como fuentes de carbono; y recuperar el copolímero [poli (3HHx-co-3HO-co-3HD-co-lactato) ] y lactato a partir de las células cultivadas, en donde dicho ácido graso es ácido decenoico.

9. Vector recombinante que contiene un gen que codifica el gen de la propionil-CoA transferasa y un gen que codifica la sintasa de polihidroxialcanoatos seleccionada entre phaC y phaRBC.

10. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en donde phaC procede de Pseudomonas sp.

11. Células transformadas con el vector recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.

12. Procedimiento para preparar polilactato o copolímero de poli (3HB-co-lactato) , en donde el procedimiento comprende: cultivar las células transformadas de acuerdo con la reivindicación 11 en un medio que contiene lactato

o lactato y diferentes tipos de hidroxialcanoatos como fuente de carbono; y recuperar el polilactato o el copolímero de poli (3HB-co-lactato) de las células cultivadas.