Células madre hematopoyéticas tratadas mediante fucosilación in vitro y métodos de uso.

Un método para mejorar el enlace con selectina P o selectina E de células madre hematopoyéticas (CMHs) de sangre del cordón umbilical que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E,

que comprende:

tratar una cantidad de CMHs, teniendo al menos una parte de ellas un enlace disminuido con selectina P o selectina E y que se caracterizan por el ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) que carece de una α1,3-fucosa, in vitro con una α1,3-fucosiltransferasa y un donante de fucosa que forman CMHs fucosiladas, donde las CMHs fucosiladas han mejorado el enlace con selectina P o selectina E.

Células madre hematopoyéticas tratadas mediante fucosilación in vitro y métodos de uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere generalmente a métodos para tratar células madre hematopoyéticas (CMHs) para mejorar su utilidad terapéutica y más particularmente tratar células madre hematopoyéticas derivadas de sangre del cordón, y células madre hematopoyéticas así tratadas.

Durante la inflamación, la selectina P y la selectina E median cooperativamente la circulación y adhesión de leucocitos sobre superficies vasculares (McEver, R.P. Selectinas: lectinas que inician la adhesión celular bajo flujo. Curr Opin Cell Biol. 2002 Oct; 14:581-856) . En el proceso de trasplante de médula ósea, la selectina P y la selectina E también median la conducción de CMHs inyectadas intravenosamente a la médula ósea. (Frenette, P.S., Subbarao, S., Mazo, I.B., Von Andrian, U.H., Wagner, D.D. Selectinas endoteliales y molécula-1 de adhesión celular vascular promueven la conducción del progenitor hematopoyético a la médula ósea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95:14423-14428) . En la mayoría de los tejidos, la selectina P y la selectina E se expresan en células endoteliales después de la estimulación de agonistas, pero se expresan constitutivamente en células endoteliales de la médula ósea. Las selectinas usan glicanos α2, 3-sialilados y α1, 3-fucosilados tales como sialil LewisX (sLex) en glicoproteínas o glicolípidos como ligandos. La selectina P se enlaza a la región de terminal N del ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) , que contiene sulfatos de tirosina y un glicano O tapado con sLeX. La selectina E se enlaza con uno o más sitios diferentes en PSGL-1. Para interactuar con la selectina E, PSGL-1 no necesita la sulfación de tirosina, pero la expresión de sLeX sobre glicanos O mejora el enlace. La selectina E también interactúa con otros ligandos sobre CMHs. Una isoforma de CD44 sobre CMHs ha demostrado que se enlaza con la selectina E in vitro (Dimitroff, C. J. Lee, J. Y:, Rafii, S., Fuhlbrigge, R. C., Sackstein, R. CD44 es un ligando principal de selectina E en células madre hematopoyéticas de progenitor. J. Cell Biol. Jun 11 2001; 153:1277-1286) . Otro ligando potencial para la selectina E sobre CMHs es el ligando-1 de selectina E (ESL-1) (Wild, M. K., Huang, M. C., Schulze-Horsel, U. van Der Merwe, P.A., Vestweber, D. Afinidad, cinética y termodinámica de enlace de selectina E que se enlaza con ligando-1 de selectina E. J Biol Chem. 2001 Ago 24; 276:31602-31612) . Se piensa que cada uno de estos ligandos transporta estructuras sLeX.

Las células madre hematopoyéticas cosechadas de un individuo pueden trasplantase a la médula ósea de otro individuo siguiendo una infusión intravenosa. La técnica se ha usado en gran medida en el tratamiento de varios desordenes hematológicos tales como leucemia (Thomas, E. D, Historia, resultados actuales e investigación en trasplantes de médula ósea. Perspectives Biol. Med. 38:230-237, 1995) . Clínicamente, las CMHs humanas se obtienen de tres fuentes diferentes: médula ósea, sangre periférica adulta después de la movilización, y sangre del cordón obtenida de cordones umbilicales después del parto. Aunque hay más de 5 millones de donantes voluntarios de médula ósea no relacionados registrados en todo el mundo, encontrar un donante no relacionado que coincida completamente con el antígeno leucocitario humano (ALH) sigue siendo un problema para muchos pacientes debido al polimorfismo de ALH. En comparación con la médula ósea y la sangre periférica humana, la sangre del cordón tiene varias ventajas potenciales, en particular la amplia y rápida disponibilidad de células y menos requisitos rigurosos para la identidad de ALH entre donante y receptor debido al bajo riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) severa y crónica (Rocha, V., et al., Comparación de resultados de trasplantes no relacionados de médula ósea y sangre del cordón umbilical en niños con leucemia aguda. Blood. 97:2962-71. 2002) . Las ventajas potenciales del trasplante usando CMHs de la sangre del cordón en lugar de CMHs de la médula ósea o sangre periférica adulta incluyen: (1) un gran grupo de donantes potenciales; (2) rápida disponibilidad, ya que la sangre del cordón se ha pre-cribado y testado; (3) puede conseguirse mayor diversidad racial en los bancos al concentrar los esfuerzos de recogida en hospitales donde nacen niños bajo orígenes étnicos representados; (4) riesgo reducido de incomodidad para el donante; (5) rara contaminación por virus; y (6) menor riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (donde las células del donante atacan los órganos y tejidos del paciente) , incluso para receptores con una coincidencia de tejido menos que perfecta. De este modo, las CMHs derivadas de la sangre del cordón se han usado cada vez más para trasplante de médula ósea en años recientes.

En el escenario del trasplante, las CMHs infusionadas intravenosamente se extravasan específicamente en la médula ósea para implantar y proliferar, un proceso que se define como conducción CMH. La conducción se ha estudiado extensamente tanto in vivo como in vitro y se cree que se basa en las interacciones de la molécula de adhesión entre CMHs y el endotelio de la médula ósea. Las selectinas con un grupo de moléculas de adhesión que contienen un dominio de reconocimiento de carbohidrato en terminal N relacionado con aquellos en las lectinas animales Ca++-dependientes (tipo C) . La selectina P, expresada en plaquetas activadas y células endoteliales, y la selectina E, expresada en células endoteliales activadas, se enlazan con ligandos glicoconjugados en leucocitos y CMHs. El ligando de glicoproteína mejor caracterizado es PSGL-1, una mucina con muchos oligosacáridos enlazados con O sialilados y fucosilados. PSGL-1 se expresa en leucocitos y CMHs. Los estudios con ratones deficientes de PSGL-1 han demostrado que PSGL-1 media la atadura de leucocitos y la conducción sobre selectina P y apoya la unión de selectina E en flujo. PSGL-1 también se enlaza con la selectina L, que inicia las interacciones leucocito-leucocito que amplifican la conducción de leucocitos sobre superficies de células endoteliales inflamadas. En PSGL-1 humano, el sitio de enlace de la selectina P y la selectina L comprende una secuencia peptídica que contienen tres residuos de sulfato de tirosina cercanos a una trionina a la que se une un específico glicano-O núcleo2 fucosilado ramificado (McEver, R. P., Cummings, R. D. Papel de enlace de PSGL-1 con selectinas en reclutamiento de leucocitos. J Clin Inves. 100:S97-103. 1997; R. P. McEver: Selectinas: Ligandos que inician la adhesión celular bajo flujo. Curr. Op. In Cell Biol. 14: 581-586, 2002) . La fracción de fucosa es esencial para el enlace de selectina P como se mide por ensayos in vitro que usan glicosulfopéptidos sintéticos. La fucosilación se cataliza por una familia de α1, 3-fucosiltransferasas. Entre ellas, α1, 3-fucosiltransferasa IV (FT-IV) y α1, 3fucosiltransferasa VII (FT-VII) se expresan principalmente en leucocitos humanos. Estas enzimas catalizan la transferencia de un residuo de fucosa de un donante, por ejemplo, GDP-fucosa, a un receptor en unión α1, 3 a GIcNAc en secuencias Gal-GlcNac. Tanto FT-IV como FT-VII hacen la adición de fucosa que es necesaria para formar la estructura de sLeX (NeuAcα2, 3Galβ1, 4[Fucα1, 3]GlcNacβ1-R) . El sLeX sobre un O-glicano núcleo-2 unido a una treonina específica en la secuencia de aminoácido de terminal N de PSGL-1 humano es fundamental para el enlace con selectina P.

Las CMHs tienen el potencial para diferenciarse en diferentes linajes de células hematopoyéticas tales como glóbulos rojos, células mieloides, linfocitos y plaquetas. Las CMHs humanas expresan una glicoproteína de superficie, CD34, que rutinariamente se usa para la identificación y separación de CMH. Tales células humanas CD34+ (células que expresan antígeno CD34) representan una población heterogénea de progenitores con varios grados de maduración hematopoyética. La ausencia de (“-“) o la expresión reducida (“baja”) de otra proteína de superficie, CD38, en células humanas CD34+ se considera que es un marcador sustituto de una sub-población primitiva de células CD34+. De este modo, las células de la sub-población CD34+CD38baja/-, que comprende aproximadamente el 10-20% del total de células CD34+ de la médula ósea o sangre periférica adulta, están altamente enriquecidas para el multiprogenitor y la actividad de la célula madre, incluyendo la habilidad de injerto. Notablemente, aproximadamente el 30% de las CMHs de la sangre del cordón son CD34+CD38baja/-. Sin embargo, a diferencia de las células... [Seguir leyendo]

1. Un método para mejorar el enlace con selectina P o selectina E de células madre hematopoyéticas (CMHs) de sangre del cordón umbilical que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E, que comprende: tratar una cantidad de CMHs, teniendo al menos una parte de ellas un enlace disminuido con selectina P o selectina E y que se caracterizan por el ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) que carece de una α1, 3-fucosa, in vitro con una α1, 3-fucosiltransferasa y un donante de fucosa que forman CMHs fucosiladas, donde las CMHs fucosiladas han mejorado el enlace con selectina P o selectina E.

2. El método de la reivindicación 1 donde al menos una parte de la cantidad no tratada de CMHs carecen de o tienen una expresión reducida de proteína de superficie CD38.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde una parte de la cantidad no tratada de CMHs tiene una habilidad reducida de conducción a la médula ósea.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde una parte de la cantidad no tratada de CMHs expresa PSGL-1 que tiene glicanos no fucosilados u O-glicanos no fucosilados.

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde una parte de la cantidad no tratada de CMHs expresa PSGL-1 que tiene O-glicanos núcleo-2 que comprenden NeuAcα2, 3Galβ1, 4GlcNac y que carecen de una fucosa en la unión α1, 3 con el GlcNAc o que comprenden otros glicanos que carecen de fucosilación apropiada.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde en la etapa de tratar la cantidad de CMHs, al menos el 50% de las CMHs tratadas tienen fluorescencia de enlace con selectina P que excede un umbral de fluorescencia predeterminado en un ensayo de selectina P o que tienen fluorescencia de enlace con selectina E que excede un umbral de fluorescencia predeterminado en un ensayo de selectina E.

7. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde en la etapa de tratar la cantidad de CMHs, la α1, 3 fucosiltransferasa es una α1, 3 fucosiltransferasa IV, una α1, 3 fucosiltransferasa VI, o una α1, 3 fucosiltransferasa VII.

8. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde en la etapa de tratar la cantidad de CMHs, el donante de fucosa es GDP-fucosa.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde las CMHs no tratadas se derivan de sangre del cordón umbilical.

10. El método de la reivindicación 9 donde la sangre del cordón umbilical humano es una cantidad no fraccionada de sangre del cordón umbilical humano.

11. Una composición de CMHs de sangre del cordón umbilical, que comprende: CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical que carecen de o tienen una expresión reducida de proteína de superficie CD38; donde las CMHs de sangre del cordón umbilical se han fucosilado in vitro de tal manera que al menos el 10% de las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlazan con selectina E o selectina P; y un transportador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 11 donde las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se han fucosilado con una α1, 3-fucosiltransferasa.

13. La composición de la reivindicación 11 ó 12 donde al menos el 25% del las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlaza con selectina P o selectina E.

14. La composición de la reivindicación 11 ó 12 donde al menos el 50% del las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlaza con selectina P o selectina E.

15. La composición de la reivindicación 11 ó 12 donde al menos el 75% del las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlaza con selectina P o selectina E.

16. La composición de la reivindicación 11 ó 12 donde al menos el 90% del las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlaza con selectina P o selectina E.

17. La composición de la reivindicación 11 ó 12 donde al menos el 95% del las CMHs CD34+ de sangre del cordón umbilical se enlaza con selectina P o selectina E.

18. CMHs de sangre del cordón umbilical de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11-17 para su uso en el tratamiento de una enfermedad hematológica, una enfermedad autoinmune, enfermedad de Gunther,

síndrome de Hunter, síndrome de Hurler, neuroblastoma, linfoma no-Hodgkin, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X, tumores de tejido sólido, cáncer de mama, o para reconstituir la médula ósea en un sujeto irradiado o un individuo sometido a quimioterapia, o para tratar un paciente cuya médula ósea se haya destruido por terapia ablativa.

19. CMHs de sangre del cordón umbilical de la composición de la reivindicación 18 donde la enfermedad hematológica es una de leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, mielodisplasia, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena crónica juvenil, anemia aplásica grave o anemia de células falciformes.

20. Un producto de sangre que contiene CMHs de sangre del cordón umbilical que comprende: una población de CMHs de sangre del cordón umbilical fucosiladas que comprenden células caracterizadas como CD34+CD38baja/-, donde las CMHs de sangre del cordón umbilical se han fucosilado en vitro de tal manera que al menos el 10% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlazan con selectina P o selectina E.

21. El producto de sangre de la reivindicación 20 que además comprende un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. El producto de sangre de las reivindicaciones 20 ó 21 que además comprende una fucosiltransferasa libre o una fucosiltransferasa unida a un suporte.

23. El producto de sangre de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22 donde al menos el 25% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.

24. El producto de sangre de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22 donde al menos el 50% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.

25. El producto de sangre de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22 donde al menos el 75% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.

26. El producto de sangre de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22 donde al menos el 90% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.

27. El producto de sangre de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22 donde al menos el 95% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.

28. Un método para mejorar el enlace con selectina P o selectina E de células madre hematopoyéticas (CMHs) de sangre del cordón umbilical que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E, que comprende: tratar una cantidad de CMHs que comprenden PSGL-1 que tiene O-glicanos núcleo-2 que comprende

NeuAcα2, 3Galβ1, 4GlcNac que carecen de fucosa en la unión α1, 3 con el GlcNAc y que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E in vitro con una α1, 3-fucosiltransferasa y un donante de fucosa para producir CMHs fucosiladas donde al menos el 10% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.

29. El método de la reivindicación 28 donde al menos una parte de la cantidad no tratada de CMHs carecen de o tienen una expresión reducida de proteína de superficie CD38.

30. el método de la reivindicación 28 ó 29 donde la cantidad de CMHs está dispuesta dentro de un transportador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

31. El método de una cualquiera de las reivindicació.

2. 30 que comprende el uso de una fucosiltransferasa libre o una fucosiltransferasa unida a un soporte para tratar las CMHs.

32. El método de una cualquiera de las reivindicació.

2. 31 donde la cantidad de CMHs se deriva de sangre del cordón umbilical humano.

33. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 32 donde al menos el 25% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.

34. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 33 donde al menos el 50% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.

35. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 34 donde al menos el 75% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.

36. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 35 donde al menos el 90% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.

37. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 36 donde al menos el 95% de las CMHs fucosiladas se enlaza con selectina P o selectina E.