Bacterias resistentes a 5-fluorouracilo y método para su producción.

Un método para producir una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidostumorales anaeróbicos,

que expresa citosina desaminasa y que tiene resistencia a 5-fluorouracilo a unaconcentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, en el que un gen de citosina desaminasa esintroducido en una bacteria entérica que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos y que no tiene un gen decitosina desaminasa, para obtener una bacteria que expresa citosina desaminasa transformada, y un subcultivo ocultivo de aclimatación de la bacteria que expresa citosina desaminasa transformada se realiza repitiendo al menostres tandas de cultivo con un medio complementado con 2 a 5000 μg/ml de 5-fluorocitosina durante al menos 24horas.

Bacterias resistentes a 5-fluorouracilo y método para su producción

Campo técnico La presente invención se refiere a un método para producir citosina desaminasa (EC3.5.4.1; denominada en lo sucesivo CD) que expresa bacterias entéricas resistentes a 5-fluorouracilo (denominado en lo sucesivo 5-FU) , que es útil como agentes terapéuticos para tumores sólidos, puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, puede expresar CD y tiene una resistencia a 5-FU presente a una concentración que es al menos eficaz para una actividad antitumoral. La presente invención se refiere también a una bacteria entérica resistente a 5-FU, una composición farmacéutica que contiene la bacteria entérica resistente y un agente terapéutico que contiene la bacteria entérica resistente para tratar tumores sólidos.

Técnica antecedente La CD es una enzima que desamina citosina en uracilo (véase por ejemplo el documento no patente 1) . La CD desempeña una función importante en el metabolismo de microorganismos. La CD ha sido aislada a partir de varios microorganismos diferentes, aunque habitualmente no es producida en células de mamíferos (véase por ejemplo el documento no patente 2) . Muchas de las bacterias y hongos que producen CD convierten 5-fluoricitosina (en lo sucesivo denominada 5-FC) en 5-FU, que es un metabolito altamente tóxico y es mortal para las células. El 5-FU induce la generación de ARN anormal y la inhibición de la síntesis de ADN. La acción antifúngica de 5-FC es debida a esta generación de ARN anormal y la inhibición de la síntesis de ADN por la acción de 5-FU.

Específicamente, la 5-FC es absorbida por células fúngicas a través de citosina permeasa e inmediatamente convertida en 5-FU en la célula mediante CD. El 5-FU es seguidamente convertido a través de 5-FUMP en 5-FUDP mediante UMP-pirofosforilasa. La trayectoria de fosforilación posterior se bifurca en dos ramificaciones, produciendo 5-FUTP a través de una trayectoria y 5-FdUMP a través de la otra trayectoria. La incorporación de 5-FUTP, en lugar de UTP, en el ARN genera ARN anormal y, por tanto, inhibe la síntesis de proteínas normales, dando lugar a la inhibición del crecimiento fúngico. Además, la 5-FdUMP funciona como un potente inhibidor de timidilato sintasa e inhibe la síntesis de ADN y la división nuclear, conduciendo a un efecto antimicrobiano.

Sin embargo, como las células normales de mamífero no expresan una cantidad significativa de CD y, por tanto, la 5-FC no será desaminada en 5-FU metabolito tóxico, el 5-FC es no tóxico para las células de mamífero incluso a una concentración que muestra una potente actividad antifúngica. Por otra parte, el 5-FU es altamente citotóxico para células de mamífero también y es ampliamente usado como un agente anticancerígeno.

Los genes de CD han sido aislados y clonados a partir de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisieae (véanse por ejemplo los documentos no patente 3 y 4) . Muchos investigadores han informado que la introducción de un gen de CD en una célula de mamífero conduce a una disminución de la sensibilidad selectiva de la célula para 5-FC in vitro (véanse por ejemplo los documentos no patente 3 y 5) . Se ha informado también que las células tumorales introducidas con un gen de CD usando un vector retroviral pueden ser eliminadas in vivo mediante tratamiento sistémico del animal con 5-FC (véanse por ejemplo los documentos no patente 6-8) . Un vector retroviral de replicación defectuosa (véase por ejemplo el documento no patente 9) y un liposoma catiónica (véase por ejemplo el

documento no patente 10) son empleados también para la introducción de un gen de CD, respectivamente, en la línea celular de carcinoma de colon humano y cáncer de pulmón de células grandes de ratón. Estas expresiones génicas en células tumorales otorgan a las células una sensibilidad a 5-FC.

Es conocido que una resistencia a 5-FC, que es usada contra infecciones fúngicas, por ejemplo mediante Candida, surge fácilmente (véase por ejemplo el documento no patente 11) . Como la resistencia a 5-FC podría surgir a través de pérdida o mutación de una enzima relativa a la conversión de 5-FC en 5-FU o la incorporación de 5-FU en ARN etc., hay teóricamente una diversidad de mecanismos para obtener la resistencia. Sin embargo, clínicamente, la adquisición de una resistencia va acompañada lo más frecuentemente de una pérdida o disminución de la actividad de UMP-pirofosforilasa en Candida albicans. Es conocido también que hay una correlación obvia entre la 55 sensibilidad a 5-FC y la actividad enzimática de UMP-pirofosforilasa. Las cepas resistentes que tienen deficiencia de citosina permeasa o CD han sido descritas también en Candida glabrata, cuya fase nuclear es monoploide.

Por otra parte, Bifidobacterium longum es una bacteria anaeróbica gran-positiva y tiene un genoma con un contenido elevado de GC (véase por ejemplo el documento no patente 12) . Este Bifidobacterium longum es no patógeno y constituye una gran parte de la microflora normal en el intestino grueso de seres humanos y otros animales (véase por ejemplo el documento no patente 13) . El Bifidobacterium longum se dice que tiene propiedades favorecedoras de la salud para su hospedante, que implican una mejora de la respuesta inmune (véase por ejemplo el documento no patente 14) , efecto inhibidor de carcinogénesis (véase por ejemplo el documento no patente 15) , protección del hospedante contra infecciones virales (véanse por ejemplo los documentos no patente 16 y 17) y posibilidad de 65 producir una sustancia antibacteriana (véase por ejemplo el documento no patente 18) . Algunas especies de Bifidobacterium son ampliamente usadas en todo el mundo para preparar productos lácteos fermentados.

Además, los plásmidos para Bifidobacterium se espera que sean aplicados a vectores probióticos y vectores de vacunas orales contra enfermedades infecciosas. Por ejemplo, es conocido un método de transformación que comprende las etapas de (a) construir un vector de lanzamiento que es replicado en Bifidobacterium sp. y E. coli usando un plásmido originado a partir de Bifidobacterium sp. y el originado a partir de E. coli; (b) construir un vector 5 recombinante insertando un gen diana que codifica una proteína diana en el vector de lanzamiento; y (c) transformar el Bifidobacterium sp. usado en la etapa (a) con el vector recombinante construido en la etapa (b) (véase por ejemplo el documento patente 1) . Además, se revelado en informes recientes que el Bifidobacterium longum se acumula en tumores sólidos hipóxicos después de una aplicación sistémica (véanse por ejemplo los documentos no patente 19 y 20) y que el plásmido recombinante pBLES100-S-eCD que portan codA de E. coli fusionado a promotor hup de Bifidobacterium longum expresa CD en microorganismos (véanse por ejemplo documento patente 2, documentos no patente 21 y 22) . Estos descubrimientos apoyan la eficacia de Bifidobacterium longum recombinante para terapia de profármacos de enzimas. pBLES 100, que se usó para la construcción del plásmido recombinante pBLES100-S-eCD, es un vector de lanzamiento construido a partir de pTB6 derivado de Bifidobacterium longum y pBR322 derivado de E. coli. El vector de lanzamiento pBLES100 transformó Bifidobacterium longum con una eficacia de 2, 2 x 104 transformantes/μg de ADN, y era estable en las células en estructura y segregación (véase por ejemplo el documento no patente 23) . Sin embargo, para la clonación de un gen extraño, se requiere una eficacia de transformación incluso superior porque un plásmido que tiene un ADN no modificado puede ser escindido por una enzima de restricción en un microorganismo durante la transfección. Por tanto, los presentes inventores proponen los plásmidos pAV001 y pBRASTA101, que pueden transformar Bifidobacterium longum con 100 veces o más eficacia que pBLES100 (véase por ejemplo el documento no patente 24) .

Como se mencionó anteriormente, 5-FU es altamente citotóxico para células de mamífero también y es ampliamente usado como un agente anticancerígeno. Sin embargo, para la administración de 5-FU por sí mismo a un paciente, debe ser administrado, por ejemplo, de forma que su concentración en sangre sea de aproximadamente 1 μg/ml o menor, o incluso cuando es administrado para sobrepasar la concentración en sangre de 1 μ/ml, el tiempo durante el cual la concentración en sangre sobrepasa 1 μg/ml debe ser de aproximadamente 1 hora como máximo para evitar efectos adversos. Bajo estas situaciones, el 5-FU no se puede decir que ejerza completamente su efecto anticancerígeno con los métodos convencionales. Bajo tales circunstancias, han sido altamente deseadas medidas para tratar tumores con una concentración elevada de 5-FU... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, que expresa citosina desaminasa y que tiene resistencia a 5-fluorouracilo a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, en el que un gen de citosina desaminasa es introducido en una bacteria entérica que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos y que no tiene un gen de citosina desaminasa, para obtener una bacteria que expresa citosina desaminasa transformada, y un subcultivo o cultivo de aclimatación de la bacteria que expresa citosina desaminasa transformada se realiza repitiendo al menos tres tandas de cultivo con un medio complementado con 2 a 5000 μg/ml de 5-fluorocitosina durante al menos 24 horas.

2. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 1, en que la bacteria entérica que no tiene un gen de citosina desaminasa es una bacteria perteneciente al género Bifidobacterium.

3. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 2, en que la bacteria perteneciente al género Bifidobacterium es Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve o Bifidobacterium infantis.

4. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 3, en que la bacteria perteneciente al género Bifidobacterium es Bifidobacterium longum.

5. Un método para producir una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, que expresa citoquina desaminasa y que tiene una resistencia a 5-fluorouracilo a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, en que el método comprende:

(1) realizar un subcultivo o cultivo de aclimatación de una bacteria entérica que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos y que no tiene un gen de citosina desaminasa, repitiendo al menos tres tandas de cultivo con un medio complementado con 1 a 100 μg/ml de 5-fluorouracilo durante al menos 24 horas para producir una bacteria resistente a 5-fluorouracilo, y

(2) transformar la bacteria resistente a 5-fluorouracilo producida en el apartado (1) anterior introduciendo un gen de citosina desaminasa.

6. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 5, en el que la bacteria entérica que no tiene un gen de citosina desaminasa es una bacteria perteneciente al género Bifidobacterium. 35

7. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 6, en el que la bacteria perteneciente al género Bifidobacterium es Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve o Bifidobacterium infantis.

8. El método para producir una bacteria resistente según la reivindicación 7, en que la bacteria perteneciente al género Bifidobacterium es Bifidobacterium longum.

9. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que un gen que expresa citosina desaminasa ha sido introducido y que puede crecer en un medio complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μg/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es

un a cepa de Bifidobacterium longu.

10. A que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

10. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que ha sido introducido un gen que expresa citosina desaminasa y que puede crecer en un medio complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μ/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es una cepa de tipo Bifidobacterium breve que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

11. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que ha sido introducido un gen que expresa citosina desaminasa y que puede crecer en un medio complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μg/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es

una cepa de Bifidobacterium breve aS-1 que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

12. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo introducida que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que ha sido introducido un gen que expresa citosina desaminasa y que puede crecer en un medio complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μg/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es una cepa Bifidobacterium breve Bifidobacterium breve I-53-8W que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

13. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que ha sido introducido un gen que expresa citosina desaminasa y que puede crecer en un medio

complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μg/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es una cepa de tipo Bifidobacterium infantis que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

14. Una bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo que puede crecer en tejidos tumorales anaeróbicos, en que ha sido introducido un gen que expresa citosina desaminasa y que puede crecer en un medio complementado con al menos 2 μg/ml de 5-fluorocitosina o al menos 1 μg/ml de 5-fluorouracilo, en que la bacteria es una cepa Bifidobacterium infantis I-10-5 que porta el plásmido pAV001-HU-eCD, como se muestra en la figura 1.

15. Un agente terapéutico para ser usado en el tratamiento de tumores sólidos, que comprende la bacteria entérica anaeróbica resistente a 5-fluorouracilo según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.

16. El agente terapéutico para ser usado en el tratamiento de tumores sólidos según la reivindicación 15, combinado 10 con 5-fluorocitosina.

17. El agente terapéutico para tratar un tumor sólido según las reivindicaciones 15 ó 16, adicionalmente combinado con lactulosa.