Aparato y procedimiento de detección de fluctuaciones localizadas de carga iónica durante una reacción química mediante el uso de transistores de efecto de campo sensibles a iones.

Un procedimiento sensor que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de un ácido nucleico desconocido y una polimerasa;

insertar una base nucleotídica conocida para la síntesis de ácido nucleico;

detectar una salida de señal eléctrica desde un transistor de efecto de campo sensible a iones;

monitorizar la señal eléctrica para discriminar las fluctuaciones de pH; y

asociar las fluctuaciones de pH con la inserción de la base nucleotídica conocida al ácido nucleico sintetizadopara identificar una o más bases del ácido nucleico desconocido.

Aparato y procedimiento de detección de fluctuaciones localizadas de carga iónica durante una reacción química mediante el uso de transistores de efecto de campo sensibles a iones La presente invención se refiere a un aparato y procedimiento sensor y, en particular aunque no de forma exclusiva, a un aparato y procedimiento sensor adecuado para secuenciar ADN.

Los procedimientos de secuenciación de ADN han permanecido prácticamente invariables durante los últimos 20

años [1]. El método de Sanger es un método muy conocido de secuenciación de ADN y comprende síntesis de ADN con terminación de la replicación del ADN en los puntos de inserción de los didesoxinucleótidos. A la síntesis de ADN le sigue electroforesis del ADN sintetizado para separar las moléculas de ADN de acuerdo con sus proporciones masa/carga, de modo que permite la determinación de la secuencia de ADN.

Una desventaja del método de Sanger es que la electroforesis es compleja, cara y azarosa.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un aparato y procedimiento sensor que supere o mitigue al menos una de las desventajas anteriores.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento sensor que comprende las etapas de proporcionar una mezcla de un ácido nucleico desconocido y una polimerasa, insertar una base nucleotídica conocida para la síntesis de ácido nucleico, detectar la salida de una señal eléctrica de un transistor de efecto de campo sensible a iones, monitorizar la señal eléctrica para discriminar las fluctuaciones del pH y asociar las fluctuaciones del pH con la inserción de la base nucleotídica conocida en el ácido nucleico sintetizado para identificar una o más bases del ácido nucleico desconocido.

Los inventores se han dado cuenta que se pueden medir las fluctuaciones localizadas de la carga iónica que se producen en la superficie de un transistor de efecto de campo. Aunque los transistores de efecto de campo sensibles a iones ya se conocen, anteriormente se han usado para monitorizar cambios lentos de, por ejemplo, valores absolu30 tos del pH en una mezcla de reacción como un todo. No se han usado para monitorizar las fluctuaciones localizadas de la carga iónica. En una disposición conocida de una disposición del transistor de efecto de campo sensible a iones se realiza una determinación del valor absoluto del pH de la mezcla de reacción cada 30 segundos. Normalmente se producirán muchos millones de reacciones químicas entre determinaciones y esto se ve como un cambio del valor absoluto del pH. La invención permite monitorizar acontecimientos individuales de una reacción química.

Normalmente, cada acontecimiento comprenderá varias miles de moléculas todas sometidas a la misma reacción al mismo tiempo.

Preferentemente, la reacción química es la síntesis de ADN y las fluctuaciones de la carga iónica indican la inserción de didesoxinucleótidos trifosfato ( (ddNTP) y desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) .

Una limitación de las disposiciones de los transistores de efecto de campo sensibles a iones es que intentan medir valores absolutos de pH y, en consecuencia, sufren desviaciones e histéresis. La invención monitoriza las fluctuaciones de la carga iónica en lugar de valores absolutos y, por tanto, evita este problema.

Preferentemente, se monitoriza el momento en el cual se producen las fluctuaciones y la magnitud de las fluctuaciones para permitir la secuenciación de ADN o de ARNm.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un aparato sensor que comprende un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) dispuesto para generar una señal de salida eléctrica, el ISFET se pue

de exponer a un ácido nucleico desconocido, una polimerasa y una base nucleotídica conocida, medios para monitorizar la señal de salida eléctrica para discriminar las fluctuaciones del pH y medios adaptados para asociar las fluctuaciones del pH en la señal de salida eléctrica con una inserción de una base nucleotídica conocida para la síntesis de ácido nucleico para identificar una o más bases del ácido nucleico desconocido.

Preferentemente, la reacción química es la síntesis de ADN y las fluctuaciones de la carga iónica indican la inserción de didesoxinucleótidos trifosfato ( (ddNTP) y desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) .

Preferentemente, el medio de monitorización está dispuesto para monitorizar el momento en el cual se producen las fluctuaciones localizadas y la magnitud de las fluctuaciones localizadas para permitir la secuenciación de ADN o de 60 ARNm.

Sakurai y col., Anal. chem. 1992, 64, 1996-1997 divulgan la monitorización en tiempo real de las reacciones de la ADN polimerasa mediante un micro sensor del pH ISFET.

A continuación se describirá una realización específica de la invención a modo de ejemplo únicamente en referencia a las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1 muestra los cambios de pH que se producen durante la hidrólisis de pirofosfato usando un medio de reacción tamponado.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un transistor de efecto de campo abarcado por la invención;

La Figura 3 es un diagrama esquemático de un par de transistores de efecto de campo abarcados por la in

vención; y La Figura 4 es una representación esquemática de los resultados obtenidos usando el par de transistores de efecto de campo.

La secuenciación del ADN usando una realización de la invención se realiza del siguiente modo: Una cantidad de ADN de interés se amplifica usando una reacción en cadena de la polimerasa o clonación y la región de interés se ceba usando ARNm. La ADN polimerasa cataliza la síntesis de ADN mediante la incorporación de bases nucleotídicas en una cadena de ADN en crecimiento. Esto se acompaña in vivo de la hidrólisis de pirofosfato, que a pH fisiológico conduce a la liberación de iones hidrógeno [2].

dNTP PP + H2O 2 Pi+ H+

(nucleótido trifosfato) (Pirofosfato) (agua) (ortofosfato) (ion hidrógeno)

Con las flechas ' ' se pretende indicar reacciones reversibles. Con la diferencia entre los tamaños de las flechas de la derecha se pretende indicar que es más enérgicamente favorable a ir desde el pirofosfato y el agua al ortofos20 fato y un ion hidrógeno que al contrario.

Los resultados mostrados en la figura 1 demuestran la reacción de hidrólisis de pirofosfato y su efecto sobre el pH. El pH se midió usando una disposición de electrodos vítreos con mediciones del valor absoluto del pH tomadas cada 30 segundos. Se puede ver que el pH disminuye de forma gradual. La realización de la invención usa esta reacción para monitorizar la inserción de nucleótidos detectando fluctuaciones localizadas de pH que se producen en la superficie de un transistor de efecto de campo (FET) sensible a iones o adyacentes a la misma.

El FET está provisto de una capa de nitruro de silicio sensible a iones encima de la cual se proporciona una capa de polimerasa. El FET detecta la hidrólisis del pirofosfato por la pirofosfatasa que permanece unida a la enzima polime

rasa [7]. La hidrólisis es indicativa de la inserción de nucleótidos durante la síntesis de ADN. La magnitud del cambio del pH en cualquier dirección (es decir, positiva o negativa) se detecta para detectar de un modo fiable la inserción de nucleótidos, como se describe más adelante. La inserción de nucleótidos individuales se producirá aproximadamente cada 3 ms a una temperatura de 65° C, [6]) . El FET puede detectar cambios rápidos de pH y tiene una tasa de respuesta inmediata medida en un plazo de 1 ms de un cambio de pH [5].

La hidrólisis de pirofosfato causa una producción neta o consumo de iones hidrógeno dependiendo del pH al que se produce la reacción. En la realización de la invención, la reacción se lleva a cabo a pH 6, 8. A pH 6, 8, los iones hidrógeno se consumen en general en lugar de liberarse durante la inserción de nucleótidos. Por tanto, la realización de la invención monitoriza elevaciones del pH como indicadores de la inserción de nucleótidos.

Un FET sensible al pH abarcado por la invención se muestra en la figura 2. El FET es similar a un MOSFET (transistor de efecto de campo semiconductor de óxido metálico) tradicional. El FET comprende una capa dieléctrica de óxido de silicio 1, una capa sensible química de nitruro de silicio 2 y una interfaz enzima/electrolito 3. Las capas 1, 2 y la interfaz 3 se localizan entre una fuente 4 y un drenaje 5 (la configuración convencional de un FET) . El FET se 45 proporciona sobre un circuito de silicio, que está encapsulado en una resina epoxi para protegerlo de la mezcla de reactivo.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento sensor que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de un ácido nucleico desconocido y una polimerasa; insertar una base nucleotídica conocida para la síntesis de ácido nucleico; detectar una salida de señal eléctrica desde un transistor de efecto de campo sensible a iones; monitorizar la señal eléctrica para discriminar las fluctuaciones de pH; y asociar las fluctuaciones de pH con la inserción de la base nucleotídica conocida al ácido nucleico sintetizado para identificar una o más bases del ácido nucleico desconocido.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se detecta la inserción de uno o más nucleótidos al final de una cadena nucleotídica.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se detecta la inserción de un didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) al final de una cadena nucleotídica.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, en el que se observa la síntesis de ADN y las fluctua

ciones en la señal eléctrica indican la inserción de uno o más desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y la terminación de 20 la síntesis de ADN mediante la inserción de un didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) .

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el momento en el cual se producen las fluctuaciones y la magnitud de las fluctuaciones se monitorizan para permitir la secuenciación de ADN o de ARNm.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento incluye termociclado.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que además comprende repetir la reacción y 30 las etapas de detección y de monitorización varias veces para mejorar las proporciones de señal-ruido.

8. Un aparato sensor que comprende:

un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) dispuesto para generar una señal de salida eléctri

ca, pudiendo estar el ISFET expuesto a un ácido nucleico desconocido, una polimerasa y una base nucleotídica conocida; medios para monitorizar la señal de salida eléctrica para discriminar las fluctuaciones de pH; y medios adaptados para asociar las fluctuaciones de pH en la señal de salida eléctrica a una inserción de una base nucleotídica conocida para la síntesis de ácido nucleico para identificar una o más bases del ácido nu

cleico desconocido.

9. Un aparato sensor de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el transistor de efecto de campo sensible a iones está provisto de una capa unida mediante enzima.

10. Un aparato sensor de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la capa unida mediante enzima comprende polimerasa.

11. Un aparato sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que las fluctuaciones en la señal de salida eléctrica identifican la inserción de uno o más nucleótidos al final de una cadena nucleotídica. 50

12. Un aparato sensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el transistor de efecto de campo sensible a iones está configurado para generar la señal de salida eléctrica en respuesta a una reacción de hidrólisis de pirofosfato.

13. Un aparato sensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el aparato comprende dos transistores de efecto de campo sensibles a iones, estando provisto un primero de los transistores de una capa unida a enzima y estando provisto un segundo de los transistores de una capa unida no mediante enzima, y medios para determinar la diferencia entre las señales eléctricas generadas por los transistores primero y segundo, para proporcionar una señal de salida eléctrica.

14. Un aparato sensor de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los transistores primero y segundo están conectados a un primero y un segundo amplificadores operacionales y las salidas de los amplificadores operacionales se pasan a un amplificador diferente que proporciona la señal de salida eléctrica.

15. Un aparato sensor de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la señal de salida eléctrica se pasa a un electrodo localizado en la mezcla de reactivo, para mantener voltajes aplicados a los transistores primero y segundo a un nivel constante.

16. Un aparato sensor de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los transistores primero y segundo están dispuestos para formar parte de un primero y un segundo amplificadores operacionales respectivamente y las salidas de los amplificadores operacionales se pasan a un amplificador diferencial que proporciona la señal de salida eléctrica.