Antígeno de fusión utilizado como vacuna.

Un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende:

a) un resto antigénico;

b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas;

c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y

d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidosKKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 7),

en donde el resto antigénico se deriva del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) ORF 1b; yen donde la célula diana es una célula presentadora de antígeno

Antígeno de fusión utilizado como vacuna

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un antígeno de fusión. Más particularmente, la invención se refiere a un antígeno de fusión utilizado como vacuna de células T.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las reacciones inmunes mediadas por las células dependen de interacciones directas entre los linfocitos T y células que llevan el antígeno que reconocen las células T. Las células T reconocen células corporales infectadas con virus, que se replican en el interior de las células utilizando la maquinaria de síntesis de la propia célula. Sin embargo, los antígenos derivados de la replicación de un virus están presentes en la superficie de las células infectadas (por el MHC Clase I) , donde aquéllos son reconocidos por las células T citotóxicas (células T CD8+) , que pueden controlar luego la infección por destrucción de las células antes que se complete la replicación del virus. Las vacunas para profilaxis de infecciones víricas son usualmente organismos vivos atenuados con patogenicidad reducida que pueden estimular la inmunidad protectora. Las proteínas extrañas de un virus vivo que se utiliza como vacuna viva atenuada son reconocidas y procesadas en el lumen del retículo endoplásmico (ER) de las células presentadoras de antígeno (APCs) cuando el virus se replica para formar un péptido de procesamiento endógeno. El proceso incluye la modificación y digestión apropiada del antígeno. Sin embargo, una vacuna viva atenuada, especialmente en virus de RNA, tiene una tendencia muy acusada a recuperar la toxicidad y la virulencia. Por ejemplo, la toxicidad de un virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) se recupera tanto en las vacunas como en las cepas atenuadas. Además, deben realizarse pases múltiples de un virus. Por esta razón, la posibilidad de suscitar una respuesta inmune se ha puesto en duda. El desarrollo de una vacuna viva atenuada es una tarea que consume mucho tiempo.

Para evitar la recuperación de una vacuna viva atenuada, se desarrollan vacunas génicamente deficientes, tales como las vacunas de la enfermedad de Aujeszky, vacunas gI negativas, y vacunas marcadoras de PRV.

Se utilizan virus o bacterias de Vaccinia o de la viruela aviar como vectores para transporte de los genes de antígenos. Por tecnología de DNA recombinante, el tiempo para el desarrollo de una vacuna satisfactoria se reduce y pueden conseguirse al mismo tiempo serotipos múltiples de la vacuna. Ejemplos de tales vacunas son sistemas vectores del virus de la viruela aviar y de Salmonella y vacunas recombinantes de genes Syntro Vet (US) . Por otra parte, cuando un microorganismo, especialmente un virus de RNA, se utiliza como vacuna vectora, el microorganismo puede producir una nueva especie o una nueva cepa. La seguridad de tales vacunas vectoras se enfrenta de nuevo a un reto. Adicionalmente, las vacunas subunitarias recombinantes tradicionales son usualmente incapaces de desencadenar una respuesta inmune mediada por las células. Las mismas son antígenos exógenos, que son capturados en los macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. Después de la internalización de los antígenos por las APCs por pinocitosis en fase fluida o por receptores fijados a la membrana se generan péptidos de epítopes inmunógenos procedentes de antígenos exógenos. Los péptidos se generan luego en los compartimientos endosómicos de las APCs y son clasificados por las moléculas del MHC Clase II vacías para formar complejos péptido-MHC Clase II basados en las afinidades entre las moléculas del MHC Clase II y los péptidos. Los complejos péptido-MHC Clase II sufren luego translocación a la superficie de las APCs, donde aquéllos son reconocidos por las células T CD4+. Sin embargo, las proteínas de tipo subunitario reconocidas por las células T CD8+ no pueden utilizarse eficientemente como vacunas debido a que una vez administradas, se internalizan en compartimientos endosómicos, donde es probable que las mismas se degraden profundamente o no consigan interaccionar con el camino del MHC Clase I. Adicionalmente, las células CD4+ (células Th) pueden activar a la vez inmunidad humoral y respuesta inmune mediada por las células debida a la acción de las células T adyuvantes Th1 y Th2, respectivamente. Las células Th1 y Th2 se regulan unas a otras respecto al equilibrio de la inmunidad humoral y la respuesta inmune mediada por las células.

Han sido descubiertos e investigados virus que infectan las células inmunológicas tales como células T, células B, células dendríticas, monocitos, o macrófagos. Ejemplos de tales virus infectados del cerdo son el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, el circovirus tipo II, y el virus infectado humano, virus de la inmunodeficiencia humana. Tales virus destruyen la capacidad de reconocimiento de proteínas extrañas como antígenos en las células presentadores de antígeno. Las células inmunológicas no pueden suscitar una respuesta de inmunización y transportan los virus. Los animales que han sido infectados con estos tipos de virus son infectados fácilmente de modo secundario por otros patógenos. Es una lástima que falte todavía una vacuna útil direccionada a las células inmunológicas infectadas por virus.

En particular, el síndrome del virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) da como resultado pérdidas elevadas en la cría de animales todos los años. El virus infecta los macrófagos (en los alveolos y el bazo) , la microglia cerebral y los monocitos, y existe en la sangre y los órganos de los animales infectados. Los anticuerpos tienen poco efecto sobre el virus e incluso estimulan mutaciones del virus. En el mecanismo de la mejora dependiente de anticuerpos (ADE) , el uso de anticuerpos conduce a infecciones más graves. Aproximadamente 50 a 80% de los cerdos están infectados por dicho virus. Generalmente, los animales infectados por el virus no tienen síntomas significativos, pero la inmunidad de los animales infectados se reduce. Esto conduce a una disminución de la ganancia de peso y un aumento en la tasa de mortalidad debido a la infección secundaria. PRRSV es un virus de RNA. No sólo los cerdos, sino que también los patos pueden ser infectados asimismo por PRRSV. Se desarrolló una vacuna viva atenuada contra PRRSV. Sin embargo, la mutación de los virus en la vacuna viva ocurre con frecuencia. Por fortuna, informes recientes del desarrollo de vacunas de HIV indican insistentemente que las células T citotóxicas (CTLs) son esenciales para controlar la infección de HIV. (Hanne G-S et al, 2000, Journal of Virology, vol. 74, No. 4, p. 1694-1703) . Se desea urgentemente el desarrollo de una vacuna PRRS segura y eficaz.

Por tanto, existe en la técnica una necesidad no abordada hasta ahora de abordar las deficiencias e insuficiencias mencionadas anteriormente, especialmente en conexión con el desarrollo de vacunas de células T contra la infección de virus.

La publicación de Estados Unidos No. US 2004/0247617 da a conocer un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende un resto ligando que es capaz de reaccionar con, reconocer o fijarse a los receptores en la célula diana, un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas, un resto antigénico, y un resto del terminal carboxilo que permite la combinación del antígeno de fusión con la membrana del retículo endoplásmico de la célula diana.

Li, G. et al, Virus Genes (2007) 35:673-679 exponen la supresión de la replicación del PRRSV en células MARC-145 por direccionamiento de shRNA a la región ORF1.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se refiere a un antígeno de fusión que es específico para una célula diana que comprende: (a) un resto antigénico; (b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas; (c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y (d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 7) , en donde el resto antigénico se deriva del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) ORF1b, y en donde la célula diana es una célula presentadora de antígeno.

En otro aspecto, la invención se refiere a un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende a) un resto antigénico que comprende un polipéptido que es el producto de traducción de un fragmento de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2; b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas; c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende: a) un resto antigénico; b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas;

c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 7) ,

en donde el resto antigénico se deriva del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) ORF 1b; y en donde la célula diana es una célula presentadora de antígeno.

2. Un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende: a) un resto antigénico que comprende un polipéptido que es el producto de traducción de un fragmento de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2; b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas; c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y

d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos KKDLRDELKDEL (SEQ ID NO: 5) o KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO: 6) , en donde el resto antigénico se deriva del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) ORF 1b; y en donde la célula diana es una célula presentadora de antígeno.

3. El antígeno de fusión de la reivindicación 1 ó 2, en el cual el resto antigénico comprende un polipéptido que 20 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

4. El antígeno de fusión de la reivindicación 1 ó 2, en el cual el resto del terminal carboxilo está conectado al resto antigénico por un enlazador del sitio de restricción.

5. Un antígeno de fusión específico para una célula diana que comprende: a) un resto antigénico que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

1; b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas; c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO: 9) , KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO: 6) o KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 7) ;

en el cual la célula diana es una célula presentadora de antígeno.

6. El antígeno de fusión de la reivindicación 1 ó 5, en el cual la célula diana se selecciona del grupo constituido por células dendríticas, macrófagos, células B y monocitos.

7. Una composición farmacéutica que comprende el antígeno de fusión de la reivindicación 1 ó 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 que comprende adicionalmente un segundo antígeno de fusión específico para una célula diana, en el cual la segunda proteína de fusión comprende: a) un resto antigénico derivado de PRSSV ORF7; b) un dominio I de fijación de la exotoxina A de Pseudomonas; c) un dominio II de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas; y

d) un resto del terminal carboxilo que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos KDEL; en donde la célula diana es una célula presentadora de antígeno.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 ú 8 para uso como medicamento a fin de inducir una respuesta inmune en un animal contra la infección de PRRSV.

10. La composición de la reivindicación 9, en la cual el antígeno de fusión es específico para una célula diana que es una célula presentadora de antígeno seleccionada del grupo constituido por células dendríticas y macrófagos.

11. La composición de la reivindicación 9, en la cual el antígeno de fusión es específico para una célula diana seleccionada del grupo constituido por células B, células dendríticas, monocitos, y macrófagos.

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Grupos de inmunización Secreción de IFNy inducida por inmunógenos en esplenocitos de ratón inmunizado

Grupos de inmunización Secreción de TNFa inducida por inmunógenos en esplenocitos de ratón inmunizado