Antígeno CD14 soluble novedoso.

Antígeno CD14 soluble, que tiene los siguientes rasgos característicos 1) a 3):

1) un peso molecular de 13 +/- 2 kDa cuando se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;

2) una secuencia de aminoácidos en la que está presente la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:1 ensu extremo N-terminal; y

3) capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo, que se une a un péptido que consiste en lasecuencia de aminoácidos de SEO ID NO:2, preparándose el anticuerpo usando dicho péptido comoantígeno.

Antígeno CD14 soluble novedoso

Campo técnico

La presente invención se refiere a un antígeno CD14 novedoso que puede servir como marcador de diagnóstico para septicemia. La invención también se refiere a un método para diagnosticar la septicemia caracterizado por someter a ensayo el antígeno. La invención se refiere además a un fragmento de CD14 soluble recombinante útil como sustancia patrón de un kit de ensayo y a un método para producir el fragmento.

Antecedentes de la técnica Se nombró una molécula de CD14 como una proteína identificada por una familia de anticuerpos que reconocen glicoproteínas expresadas en la superficie de membrana de monocitos en la Third Leukocyte Typing Conference (Tercera Conferencia de Tipificación de Leucocitos) , 1986. En 1990, Wright et al. dilucidaron que la molécula de CD14 es un receptor para LPS, endotoxina ("Science", vol. 249, págs. 1431-1433, 1990) . La molécula de CD14 es una glicoproteína que tiene un peso molecular de 53-55 kDa, y análisis con el ADNc revelaron que ARNm de aproximadamente 1, 4 kb tiene una secuencia codificante de 356 aminoácidos ("Nucleic Acids Research" (R.U.) , vol. 16, pág. 4173, 1988) .

Se notificó que las moléculas de CD14 humana incluyen moléculas de CD14 solubles además de moléculas de CD14 unidas a membrana y la sangre contiene moléculas de CD14 solubles que tienen diferentes pesos moleculares ("European Journal of Immunology" (Alemania) , vol. 23, págs. 2144-2151, 1993) . Además, Landmann et al. llevaron a cabo análisis de western blot con CD14 soluble en suero de pacientes que presentaban septicemia y notificaron que hay CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa a altos niveles en pacientes con septicemia que no sobrevivieron y pacientes con hemoglobinuria nocturna paroxística (HNP) y que en sueros normales, no se detectó esta molécula sino que se detectó CD14 soluble de 49 kDa, un peso molecular ligeramente menor que el anterior ("The Journal of Infectious Disease" (EE.UU.) , vol. 171, págs. 639-644, 1995) .

Stelter et al. notificaron que la diferencia en las cadenas de azúcar está implicada en aquellos subtipos que tienen diferentes pesos moleculares y se encuentran dos subtipos de CD14 solubles que tienen diferentes pesos moleculares en sangre incluso tras la eliminación de cadenas de azúcar con unión a N y O ("European Journal of Biochemistr y " (Alemania) , vol. 236, págs. 457-464, 1996) . Además, Bufler et al. llevaron a cabo el análisis del extremo C-terminal con CD14 soluble y notificaron que un GPI se anclaba a un residuo de serina en la posición 327 de CD14 soluble y que una molécula de CD14 soluble que tiene un peso molecular de aproximadamente 56 kDa es una de las especies moleculares a las que no se ancla el GPI ("European Journal of Immunology" (Alemania) , vol. 25, págs. 604-610, 1995) .

En lo que respecta a CD14 soluble de longitud completa recombinante y un fragmento del mismo, Juan et al. notificaron que un fragmento 1-152 N-terminal de CD14 humana tiene una función de transmitir señales de LPS a las células ("Journal of Biological Chemistr y " (EE.UU.) , vol. 278, págs. 1382-1387, 1995) , pero no han tenido éxito en la expresión de un fragmento 1-124 N-terminal y un fragmento 1-98 N-terminal. Además, Majerle et al. notificaron que un fragmento 1-152 N-terminal de CD14 humana que incluye 3 unidades de una región de repetición rica en leucina (LRR) se repliega y un fragmento 1-134 N-terminal de CD14 humana que incluye sólo dos unidades de la región LRR no se repliega, y que no tuvieron éxito en la expresión de un fragmento 1-69 N-terminal ("Pflugers Arch-European Journal of Physiology" (Alemania) , vol. 439 [suplo], págs. R109-R110, 2000) , pero según el informe, no han tenido éxito en la expresión de un fragmento 1-69 N-terminal.

Los anticuerpos frente a moléculas de CD14 incluyen muchos anticuerpos anti-CD14, que se han preparado y usado en la identificación de proteínas CD14, tales como MEM-18 preparado por Bazil et al. ("European Journal of Immunology" (Alemania) , vol. 16, págs. 1583-1589, 1986) , RoMo-1 preparado por Shutt et al. ("Allergie und Immunologie" (Alemania) , vol. 34, págs. 17-26, 1988) , Y 3C10 preparado por Steinman et al. ("Journal of Experimental Medicine" (EE.UU.) , vol. 158, págs. 126-145, 1983) .

Además, se ha informado sobre sistemas de ensayo de CD14 soluble usando esos anticuerpos por Shutt et al. (documento DE-286876-A) , Bazil et al. ("Molecular Immunology" (R.U.) , vol. 26, págs. 657-662, 1989) Y Grunwald et al. ("Journal of Immunological Methods" (Holanda) , vol. 155, págs. 225-232, 1992) , que permiten el ensayo de CD14 soluble en líquido corporal humano.

Además, se han lanzado al mercado kits de ELlSA para CD14 soluble de IBL-Hamburg, Medgenix y R & D Systems, y se ha realizado el ensayo de CD14 soluble para muchas enfermedades tales como septicemia ("Clinical Immunology And Immunopathology" (EE.UU.) , vol. 80, págs. 307-310, 1996; Y "Rinshokensa", vol. 38, págs. 341344, 1994) .

Sin embargo, se encontró que CD14 soluble no es un marcador específico para septicemia debido a los aumentos en los niveles de moléculas de CD14 solubles de aproximadamente 55 kDa y 49 kDa (de un informe a otro, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a aproximadamente 55 kDa y 49 kDa, y se aplicará lo mismo en la siguiente descripción) dependiendo del grado de evolución de las enfermedades incluso en enfermedades a excepción de la septicemia ("Infection and Immunity" (EE.UU.) , vol. 67, págs. 417-420, 1999; "Clinical and Experimental Immunology" (R.U.) , vol. 120, págs. 483-487, 2000; y"Clinical Experimental Immunology" (R.U.) , vol. 96, págs. 15-19, 1994) . Además, se esperaba que la CD14 soluble fuese un marcador para la gravedad de la septicemia. Sin embargo, no se proporcionildo la CD14 soluble como producto de diagnóstico para septicemia debido a que no hay correlación con el choque septicémico ("Pediatric allergy and immunology) (Dinamarca) , vol. 8, págs. 194-199, 1997) Y tampoco hay correlación con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) ("European Journal of Clinicallnvestigation" (R.U.) , vol. 28, págs. 672-678, 1998) .

Además, se ha descubierto la presencia de una molécula de CD14 soluble con un bajo peso molecular de aproximadamente 36 kDa en sangre además de otras tales como las dos clases de moléculas de CD14 solubles descritas anteriormente de aproximadamente 55 kDa y 49 kDa notificadas por Landmann et al. (CD14 de alto peso molecular (de un informe a otro, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a aproximadamente 55 kDa y 49 kDa, y se aplicará lo mismo en la siguiente descripción) . También se ha descubierto la presencia de una pequeña cantidad de la CD14 de bajo peso molecular en un donante normal y de una cantidad aumentada de la CD14 de bajo peso molecular en pacientes que presentaban septicemia. Por consiguiente, se ha validado la eficacia clínica del ensayo con una CD14 de bajo peso molecular soluble. Como ensayo para la CD14 de bajo peso molecular soluble, existe una propuesta en la que se obtiene indirectamente el nivel de CD14 de bajo peso molecular en sangre restando el nivel de CD14 de alto peso molecular en sangre del nivel total de la CD14 soluble en sangre (publicación internacional WO 01/22085) .

Descripción de la invención Problemas que han de resolverse mediante la invención En vista de tal situación, un antígeno in vivo novedoso que puede servir como marcador de diagnóstico para septicemia fácilmente detectable es muy esperado. También, un kit de ensayo y un método de ensayo para el antígeno usando un anticuerpo particular son muy esperados. Además, un método para cribar un anticuerpo que es útil en el ensayo del antígeno es esperado. Todavía más, un fragmento soluble recombinante que tiene la función inmunológica similar al antígeno así como su método de producción son esperados.

Medios para resolver los problemas Tras una extensa investigación, los inventores de la presente invención encontraron un antígeno novedoso que tiene la secuencia de la CD14 en sangre humana, y también, un método para diagnosticar la septicemia o un método para detectar la septicemia que se logra sometiendo a ensayo el antígeno novedoso.

Los inventores también encontraron un fragmento soluble recombinante que tiene naturaleza inmunológica similar al antígeno, y un método para producir el fragmento, y también, un anticuerpo que se une específicamente al fragmento.

Además, los inventores encontraron un kit de ensayo y un método de ensayo que pueden someter a ensayo diversos antígenos, y el kit incluye como su constituyente "un anticuerpo que se une específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Antígeno CD14 soluble, que tiene los siguientes rasgos característicos 1) a 3) :

1) un peso molecular de 13 +/-2 kDa cuando se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;

2) una secuencia de aminoácidos en la que está presente la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:1 en su extremo N-terminal; y

3) capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo, que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:2, preparándose el anticuerpo usando dicho péptido como antígeno.

2. Fragmento de CD14 soluble recombinante, que consiste en una secuencia de aminoácidos desde una cualquiera de las posiciones 1 a 17 hasta una cualquiera de las posiciones 59 a 90 de la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 3, teniendo dicho fragmento de CD14 soluble recombinante los siguientes rasgos característicos 1) a 3) :

1) un peso molecular de 13 +/-2 kDa cuando se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;

2) sin capacidad para unirse específicamente al anticuerpo 3C10 y el anticuerpo MEM-18; y

3) capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo, que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:2, preparándose el anticuerpo usando dicho péptido como antígeno.

3. Método in vitro para diagnosticar o detectar septicemia, en el que se somete a ensayo el antígeno CD14 soluble según la reivindicación 1.

4. Método para diagnosticar o detectar septicemia según la reivindicación 3, que comprende las siguientes

etapas de:

1) someter a ensayo el antígeno CD14 soluble según la reivindicación 1 en la sangre recogida de un paciente;

2) comparar el valor sometido a ensayo con el valor habitual para un donante normal; y 3) evaluar si el sujeto tiene septicemia.

5. Método para producir el fragmento de CD14 soluble recombinante según la reivindicación 2, que comprende las etapas de:

(i) producir un fragmento de CD14 soluble recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos en la que el extremo N-terminal es una cualquiera de las posiciones 1 a 17 de SEO ID NO: 3 y el extremo C-terminal es una cualquiera de las posiciones 134 a 356 de SEO ID NO: 3; en el que se ha incorporado la secuencia de un sitio de escisión para una proteasa en el sentido de 3' de una cualquiera de las posiciones 59 a 70 de SEO ID NO: 3 mediante sustitución o inserción:

(ii) escindir el fragmento de CD14 soluble recombinante preparado en (i) con la proteasa predeterminada; y

(iii) recuperar el fragmento del lado N-terminal escindido en ii) .