Agentes terapéuticos para el tratamiento de linfoma de células del manto.

Clorhidrato de 2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]propano-1,3-diol o una sal farmacéuticamente aceptabledel mismo para su uso en un procedimiento para tratar un tumor maligno linfoide en un sujeto,

en el que el tumormaligno linfoide es linfoma de células del manto (LCM).

Agentes terapéuticos para el tratamiento de linfoma de células del manto

ANTECEDENTES

A pesar del progreso que se ha hecho en el tratamiento de tumores malignos linfoides, tales como leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (LLC) , la mayoría de los pacientes con cada una de estas enfermedades desarrollan eventualmente resistencia y por último lugar mueren de su leucemia. En LLA y LLC 10 se ha mostrado que los mecanismos de resistencia implican alternancia en la expresión de miembros de la familia Bcl-2 que previene la apoptosis y la señalización anómala mediante rutas de PKC, PI3 cinasa/AKT y ERK en parte mediadas por interacciones de células del estroma. Por tanto, se necesitan nuevas terapias que actúen mediante mecanismos de acción novedosos que actúen tanto independiente de la expresión de miembros de la familia Bcl-2 como antagonicen rutas de transducción de señales anómalas para tanto LLC como LLA. Los linfocitos normales utilizan serina/treonina fosfatasas tales como PP1, PP2A y PP2B para tanto inactivar las rutas de transducción de señales como antagonizar la acción de miembros de la familia Bcl-2 que incluyen Bcl-2 y Bad. En trastornos linfoproliferativos de linfocitos B, estas mismas fosfatasas son frecuentemente silenciadas, un proceso que puede contribuir adicionalmente a la resistencia a fármacos observada en estas enfermedades. No se han probado agentes terapéuticos que activen serina/treonina fosfatasas tales como PP2A en la clínica para LLC y LLA.

FTY720 (clorhidrato de 2-amino-2-[2- (4-octilfenil) etil]propano-1, 3-diol) es un compuesto sintético producido por modificación de un inmunodepresor natural, ISP-1. Se observó que FTY720 interfería en el tráfico de linfocitos T y en estudios preclínicos se demostró que prolongaba la supervivencia de órganos de aloinjerto trasplantados sin toxicidad evidente para el huésped. Estudios clínicos de fase I/II temprana de FTY720 para tratar y

prevenir rechazo de órgano demostraron ser prometedores. Como consecuencia, FTY720 está actualmente en ensayos clínicos de fase III como inmunodepresor para rechazo de trasplante renal. FTY720 provoca una linfopenia resultante de una redistribución reversible de linfocitos de la circulación a tejidos linfoides secundarios. FTY720 se fosforila por esfingosina cinasa y el compuesto fosforilado es un potente agonista en cuatro receptores de esfingosina-1-fosfato que modulan respuestas quimiotácticas y el tráfico de linfocitos. Se ha mostrado que FTY720

se une al receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P) , produciendo una disminución del número de linfocitos maduros en circulación por aceleración de la recirculación de linfocitos. Estudios previos también han sugerido que FTY720 también podría promover la activación de la serina/treonina fosfatasa PP2A.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1: Diagrama esquemático de FTY720.

Fig. 2: Citotoxicidad mediada por FTY720 en líneas de linfocitos B MEC, Ramos, Raji y 697 -Análisis cinético de la dosis y el tiempo. Células MEC (panel a) , Ramos (panel b) , Raji (panel c) o 697 (panel d) 40 (1 x 105 células/ml) se incubaron en presencia de las concentraciones indicadas de FTY720 o vehículo DMSO durante 24 horas (barra rellena) o 48 horas (barra en rejilla) . Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. Las células se analizaron por citometría de flujo y los datos se recogieron en modo de lista. Los datos mostrados representan % de células viables por anexina VTPI ± DE que están normalizadas a control de medio. (n=3; *p<0, 001) cuando se comparan con control de 45 medio) .

Fig. 3: Citotoxicidad mediada por FTY720 en linfocitos B CD19+ de pacientes con LLC - Análisis cinético de la dosis y el tiempo. Linfocitos B CD19+ purificados de pacientes con LLC (1 x 106 /ml de medio) se incubaron con concentraciones indicadas de FTY720 o vehículo DMSO durante 24 horas (panel izquierdo) o 48

horas (panel derecho) . Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. Las células se analizaron por citometría de flujo y los datos se recogieron en modo de lista. Los datos mostrados representan % de células viables por anexina V-/YP- ± DE que están normalizadas a control de medio (n=15) *p<0, 001 cuando se comparan con control de vehículo sin tratar)

Fig. 4. La citotoxicidad inducida por FTY720 en células de LLC es independiente de la activación de caspasas. Panel 4a: Linfocitos B purificados de pacientes con LLC (1 x 106 /ml de medio) se incubaron con FTY720 10 uM en presencia o ausencia de z-VAD-fmk (150 uM) durante 24 horas. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. Las células se analizaron por citometría de flujo y los datos se recogieron en modo de lista. Los datos mostrados representan % de células viables por anexina V-/YP- ± DE que están normalizadas a control de medio. (n=3;*p=0, 001 cuando se comparó con el grupo tratado con FARA; **p=0, 998 cuando se comparó con el grupo tratado con FTY720) . Panel 4b: Linfocitos B purificados de pacientes con LLC (1x106 /ml de medio) se incubaron con DMSO (ninguno) o FTY720 10 uM durante 24 y 48 h. Los análisis de transferencia Western de los lisados de cada una de las condiciones se evaluaron para PARP, caspasa 3, caspasa 8 y caspasa 9 escindida y sin escindir como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. La flecha en negrita indica la forma sin escindir de cada una de las proteínas y las flechas discontinuas indican productos escindidos. Como controles positivos se usaron lisados de células de Jurkat sin tratar y tratados con UV.

Fig. 5. La citotoxicidad inducida por FTY720 en linfocitos B es independiente de Bcl-2. Células 697 transfectadas con vector vacío 697-neo (barra en rejilla) o 697-bcl-2 (barra rellena) (1 x 105 células/ml) se incubaron en presencia de las concentraciones indicadas de FTY720 o vehículo DMSO durante 24 horas. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. Las células se analizaron por citometría de flujo y los datos se recogieron en modo de lista. Los datos mostrados representan % de células viables por anexina V-/YP- ± DE que están normalizadas a control de medio.

Fig. 6. La citotoxicidad inducida por FTY720 en células de LLC depende de la activación de PP2A. Panel a: FTY720 indujo actividad de PP2A en linfocitos B CD19+ de pacientes con LLC: Linfocitos B 20 purificados de pacientes con LLC (1 x 106 /ml de medio) se incubaron con DMSO o FTY720 10 uM durante 0, 1, 2, 3 ó 15 horas. La actividad de PP2A en los lisados celulares se midió como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. El panel izquierdo muestra la cinética del tiempo de un experimento representativo. El panel derecho muestra el resumen de la actividad de PP2A a las 4 horas en 5 muestras independientes en respuesta a DMSO, FTY720 10 uM ó 1, 9-didesoxi-forskolina. Panel b: La actividad de PP2A inducida por FTY720 en linfocitos B 25 CD19+ se inhibe por ácido okadaico. Linfocitos B purificados de pacientes con LLC (1 x 106 /ml de medio) se pretrataron con medio o ácido okadaico (5 nM) durante 2 horas, seguido de incubación con DMSO o FTY72 10 µM durante periodos de tiempo indicados. La actividad de PP2A en los lisados celulares se midió como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos” (n=4. *p<0, 001 cuando se comparó con el grupo tratado con FTY720) . Panel c: La citotoxicidad celular inducida por FTY720 es parcialmente rescatada por ácido okadaico. Linfocitos B 30 purificados de pacientes con LLC (1 x 106 /ml de medio) se pretrataron con medio o ácido okadaico (5 nM) durante 2 horas, seguido de incubación con DMSO o FTY720 10 uM. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio como se describe en la sección de “Materiales y procedimientos”. Las células se analizaron por citometría de flujo y los datos se recogieron en modo de lista. Los datos mostrados representan % de células viables por anexina V-/YP- ± DE que están normalizadas a control de medio (n=4; *p=0, 06 cuando se comparó con el grupo tratado con FTY720) .

Fig. 7. La citotoxicidad inducida por FTY720 en la línea de linfocitos B Ramos depende de la activación de PP2A. Panel a: FTY720 indujo actividad de PP2A inducida en la línea de linfocitos B Ramos. Se incubaron linfocitos B Ramos (1 x 105 /ml de medio) con DMSO, FTY720 10 uM ó 1, 9-didesoxi-forskolina... [Seguir leyendo]

1. Clorhidrato de 2-amino-2-[2- (4-octilfenil) etil]propano-1, 3-diol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento para tratar un tumor maligno linfoide en un sujeto, en el que el tumor 5 maligno linfoide es linfoma de células del manto (LCM) .

2. El producto de la reivindicación 1, en el que el sujeto es resistente a otros tratamientos.

3. El producto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sujeto es un sujeto humano. 10

4. Clorhidrato de 2-amino-2-[2- (4-octilfenil) etil]propano-1, 3-diol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento para prevenir un tumor maligno linfoide en un sujeto en riesgo de desarrollar un tumor maligno linfoide, en el que el tumor maligno linfoide es linfoma de células del manto (LCM) .

5. El producto de la reivindicación 4, en el que el sujeto es un sujeto humano.

6. Uso de clorhidrato de 2-amino-2-[2- (4-octilfenil) etil]propano-1, 3-diol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un tumor maligno linfoide en un sujeto, en el que el tumor maligno linfoide es linfoma de células del manto (LCM) .

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el sujeto es un sujeto humano.

8. Uso según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el medicamento es para el tratamiento, y

en el que el sujeto es resistente a otros tratamientos. 25