Un péptido aislado y purificado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y análogos funcionales equivalentes de los mismos, compartiendo dichos análogos funcionales al menos un 83 % de identidad de secuencias por pares sobre las 36 posiciones alineadas de la SEQ ID NO: 3, siendo dicho péptido capaz de bloquear con gran afinidad y especificidad un canal de potasio Kv1.3.

Vm23 y Vm24, dos péptidos de alacrán que bloquean con alta selectividad los canales de potasio (subtipo Kv1.3) de los linfocitos T humanos 5

Campo de la invención

La presente invención está relacionada de forma general con los campos de la bioquímica, biología molecular, inmunología y electrofisiología. Lo divulgado son péptidos, sus composiciones farmacéuticas y métodos para su uso como bloqueadores de canales de potasio Kv1.3, su uso para el tratamiento de varias condiciones inmunológicas y para aplicaciones de diagnóstico, y métodos para la síntesis química y procedimientos para el plegamiento correcto de estos péptidos correspondientes a dos componentes de proteína aislados del veneno del alacrán Mexicano Vaejovis mexicanus smithi (de aquí en adelante abreviado V. mexicanus) , los cuales constituyen una nueva subfamilia de ligandos específicos para canales de potasio, capaces de bloquear con alta afinidad y especificidad un subtipo de canales de potasio (hKv1.3) , el cual está implicado en enfermedades inmunológicas y rechazo de injertos. Los métodos y técnicas utilizadas para su caracterización química y funcional se revelan, así como, los resultados de los experimentos in vivo en la respuesta de hipersensibilidad tardía (DTH) de ratas sensibilizadas cuando son tratadas con Vm24. Este péptido (Vm24) , su homólogo Vm23 y sus análogos equivalentes funcionales son compuestos clave, candidatos para el tratamiento de varias condiciones inmunológicas y aplicaciones en diagnóstico.

Antecedentes de la invención

Consideraciones generales Varios aspectos deben ser tomados en consideración respecto al objeto de la invención reportada aquí, entre los cuales están los avances importantes en los campos de la bioquímica, biología molecular, inmunología y electrofisiología relacionados con el conocimiento generado acerca de:

1) -la presencia de proteínas integrales de las membranas biológicas denominadas "canales iónicos" jugando un papel fundamental en la comunicación celular, vías de transducción de señales y la homeostasis general de los tejidos y funciones de varios órganos;

2) -diferentes niveles de expresión de estos canales en células del sistema inmune, principalmente en linfocitos T, mostrando jugar un claro papel en eventos relacionados a un conjunto de enfermedades autoinmunes;

3) -el posible control de la función de los canales, por lo tanto, el posible tratamiento de trastornos, mediante la adición de diversos productos químicos, ligandos naturales y substancias sintéticamente preparadas, ya sea reproduciendo al ligando encontrado en la naturaleza o preparando derivados similares (peptidomiméticos) .

Una multitud de canales de potasio (K) se han descubierto y reportado existir en los últimos 15 años, permitiendo su purificación, expresión individual y análisis funcional.

45 Son proteínas multiméricas implicadas en la determinación del potencial de membrana celular, controlando así el tono del músculo liso, excitabilidad sináptica, liberación de neurotransmisores y otros procesos. En la presente invención se desea enfatizar la importancia de las especies de canales de K, subtipo Kv1.3, y su papel en la proliferación de los linfocitos y en el control de enfermedades autoinmunes por medio de la inhibición de este canal. Este es un canal rectificador tardío, expresado predominantemente en linfocitos T [Grissmer et al., 1990; Lewis y Cahalan, 1995] a diferencia de los subtipos Kv1.1, Kv1.2 ampliamente distribuidos en cerebro o el Kv1.5 en tejido cardíaco, por mencionar sólo algunos de los subtipos de canales de potasio.

El mecanismo por el cual la modulación de la activad de los canales Kv1.3 afecta la proliferación de los linfocitos 55 está siendo investigado en varios laboratorios y fueron objeto de muchas publicaciones recientes (revisado en [Beeton y Chandy, 2005; Judge y Bever, 2006, Panyi et al, 2006], incluyendo algunas patentes (tal como los documentos US 5.397.702 de Cahalan et al. 1995 y US 6.077.680 de Kern et al. 2000) .

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por su considerable morbilidad en todo el mundo. Entre estas enfermedades están: diabetes mellitus tipo 1 (insulinodependiente) esclerosis múltiple (EM) , artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, enfermedades mixtas del tejido conectivo, lupus eritematoso sistémico (LES) , miastenia gravis, por mencionar sólo algunas de ellas. Un modelo experimental relevante para las enfermedades autoinmunes es la encefalitis autoinmune experimental (EAE) . Es generalmente aceptado que estas enfermedades autoinmunes resultan de la respuesta del sistema inmune destruyendo tejidos específicos, ya sea por ataque directo a las células 65 o por la producción de auto-anticuerpos. La sobre-expresión de canales Kv1.3 es un rasgo característico de las células T auto reactivas, proporcionando así una excelente oportunidad para la modificación de su proliferación por los bloqueadores de Kv1.3

En estas líneas de investigación y experimentación, se han descrito e incluso patentado varias substancias. Uno de estos ejemplos es la toxina Shk de la anémona marina Stichoactyla helianthus y varios de sus derivados afirmando 5 tener un efecto protector en contra de varias enfermedades autoinmunes (tal como el documento US 6.077.680 de Kera et al. 2000)

Entre otros ligandos naturales que son capaces de afectar a la función de los canales iónicos están los péptidos tóxicos aislados del veneno de los alacranes. Los péptidos específicos para canales de K aislados de estos venenos son péptidos de cadena corta que contienen de 22 a 42 aminoácidos compactados por tres o cuatro puentes de disulfuro. Son bloqueadores de diferentes sub-tipos de canales con una enorme variabilidad en selectividad y afinidad (revisad por [Giangiacomo et al., 2004; Rodriguez de la Vega y Possani, 2004]) . Por ejemplo, caribdotoxina es un bloqueador potente de los canales de potasio rectificadores tardíos tipo shaker Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.3 pero también boquea los canales de potasio dependientes de calcio K (Ca) tipo maxi [Rauer et al., 2000] Margatoxina, otro 15 péptido del veneno de alacranes, no tiene actividad bloqueadora sobre canales K (Ca) pero bloquea con alta afinidad a los canales Kv1.3. [Garcia-Calvo et al., 1993] Angiotoxina, noxiustoxina, kaliotoxina son ejemplos de toxinas de alacrán que afectan diferentes tipos de canales de K con distintas afinidades y selectividades, pero usualmente modifican más de un sub-tipo de canales (revisado recientemente por [Panyi et al., 2006]) . Debido a su relativamente rígida estructura tridimensional, estabilizada por los puentes de disulfuro, algunos de estos péptidos de alacrán se han utilizado como "pinzas moleculares" para medir las distancias entre los residuos de aminoácidos en el vestíbulo externo de los canales de potasio [Krezel et al., 1995; Garcia et al, 2000]. La estructura tridimensional de muchas toxinas de alacrán específicas para canales de K se resolvió por resonancia magnética nuclear y/o métodos de difracción de rayos X, y en conjunto con la ya conocida estructura de algunos canales de K han proporcionado una clave para modelar la interacción entre el receptor (canal iónico) y el ligando (toxina de alacrán) . Mutagénesis dirigida al sitio de residuos de aminoácidos tanto sobre el canal iónico como en los ligandos han proporcionado información para la identificación de una superficie putativa de interacción entre el par de proteínas receptor-ligando [Rodriguez de la Vega et al., 2003]. Esta información es fundamental para el diseño racional de fármacos con potencial de posibles aplicaciones farmacológicas. El único problema en el uso de estos péptidos naturales como fármacos potenciales es que carecen de especificidad y afinidad. En la actualidad, hay 20 sub-familias de toxinas de alacrán comprendiendo 125 péptidos estructuralmente relacionados, clasificados por su similitud de secuencia y posible función [Tytgat et al., 1999; Rodriguez de la Vega y Possani, 2004].

Los siguientes ejemplos también pueden ser mencionados:

BATISTA CESAR V F ET AL: (BIOPHYSICA ACTA, Vol. 1601, No. 2, páginas 123 a 131) da a conocer 2 novedosas toxinas del alacrán amazónico Tityus cambridgei que bloquean los canales Kv1.3 y shaker B K+; el documento WO 2006/116156 A da a conocer agentes terapéuticos de péptidos de toxina; EP0916681 A se refiere a neuropéptidos que se originan en el alacrán; y OLAMENDI-PORTUGAL ET AL, (2005) (TOXICON, ELMSFORD, NY, US, vol. 46, no. 4, p. 418-419) se refiere a novedosos péptidos ct-KTx a partir del veneno de alacrán.... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado y purificado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y análogos funcionales equivalentes de los mismos, compartiendo dichos análogos funcionales al menos un 83 % de identidad de secuencias por pares sobre las 36 posiciones alineadas de la SEQ ID NO: 3, siendo dicho péptido capaz de bloquear con gran afinidad y especificidad un canal de potasio Kv1.3.

2. Un péptido tal como se define en la reivindicación 1, para su uso en la atenuación de una vía de serialización de calcio en células de linfocito T de un mamífero, en el que el uso comprende poner en contacto una población de las células de linfocito T con el péptido, preferiblemente en el que dicho mamífero es un ser humano.

3. Un método in vitro para inhibir la actividad de los canales de potasio Kv1.3 en una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una cantidad efectiva de un péptido tal como se define en la

reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente en el que la célula de mamífero es una célula de linfocito humano.

4. Un método in vitro de atenuación de una vía de señalización de calcio en una célula de linfocito T que comprende poner contacto la célula de linfocito T con una cantidad efectiva de un péptido tal como se define en la reivindicación 1.

5. Un péptido tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable para su uso en la supresión del proceso de activación de las células T en el sistema inmune de un mamífero, en el que el uso comprende poner en contacto una población de las células T con el péptido, preferiblemente en el que el mamífero es un ser humano.

6. El péptido de la reivindicación 5, en el que la activación de las células T es causada por una respuesta inmune en el mamífero, preferiblemente en el que la respuesta inmune es el resultado del rechazo de órganos heterólogos o preferiblemente en el que la respuesta inmune es el resultado de una enfermedad autoinmune.

7. Una composición que comprende un péptido tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en la supresión de una respuesta autoinmune en mamíferos, preferentemente en la que la respuesta inmune es el resultado del rechazo de órganos heterólogos o preferentemente en la que la respuesta inmune es el resultado de una enfermedad autoinmune.

8. Una composición que comprende un péptido tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico del rechazo de órganos heterólogos en un sujeto en necesidad del mismo, preferiblemente en la que el órgano rechazado es un corazón, un pulmón, un hígado, un riñón o un páncreas, o en la que el sujeto en necesidad de dicho tratamiento es un ser humano.

9. Una composición que comprende un péptido tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de mismo para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad autoinmune asociada a linfocitos TEM en un sujeto en necesidad del mismo, preferiblemente en la que el sujeto en

45 necesidad de dicho tratamiento es un ser humano, o en la que la enfermedad autoinmune asociada a linfocitos TEM se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes tipo I, psoriasis autoinmune, lupus eritematoso, colitis ulcerosa, oftalmia simpática, enfermedad periodontal y reabsorción ósea, púrpura trombocitopénica inmune y síndrome linfoproliferativo autoinmune.

10. La composición de la reivindicación 9, que además comprende al menos un agente inmunosupresor adicional adecuado para ser administrado al sujeto, preferiblemente en la que el agente inmunosupresor adicional se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina ShK, derivados de ShK y desoxispergualina, sus derivados, o una sal del mismo.

55 11. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente al menos un agente inmunosupresor adicional, preferiblemente en la que el agente inmunosupresor adicional opcional se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina ShK, derivados de ShK y desoxispergualina, sus derivados, o una sal del mismo.

12. La composición de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que es adecuada para ser administrada por vía tópica, sistémica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, transdérmica, oral, o mediante inyección intradérmica, instilación endobronquial, por vía gastrointestinal, o por vía transmucosa.

65 13. El péptido de la reivindicación 1, el cual además comprende un resto de marcado.

14. El péptido marcado de la reivindicación 13, en el que el resto de marcado se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radiactivo, un resto fluorescente, un resto quimioluminiscente, un cromóforo, un ligando tal como biotina y una proteína, preferiblemente en el que la proteína de marcado es un anticuerpo o una proteína verde fluorescente o una proteína derivada de la proteína verde fluorescente con espectros de emisión diferentes.

15. Un método in vitro para la identificación de las células que expresan canales Kv1.3 que comprende las etapas de: a) poner en contacto una población de las células blanco con un péptido marcado tal como se define en la reivindicación 13 o la reivindicación 14; b) detectar el péptido marcado unido a los canales de potasio Kv1.3 presentes en dicha población de las células blanco por una técnica de detección, preferiblemente en el que las células son linfocitos humanos.

16. Un método in vitro para cuantificar el número de canales Kv1.3 expresados en una célula dada, que comprende las etapas de: a) poner en contacto dicha célula con el péptido marcado tal como se define en la reivindicación 13 o la reivindicación 14; b) detectar y cuantificar el péptido marcado unido a los canales de potasio Kv1.3 presentes en dicha población de las células blanco por técnicas de detección cuantitativa, preferiblemente en el que las células son linfocitos humanos.