Vacuna purificada que comprende:

(a) un polipéptido adyuvante que comprende un primer polipéptido unido a un segundo polipéptido,

en la que el primer polipéptido es un polipéptido de mucina y se glicosila por una α1,3-galactosiltransferasay el segundo polipéptido comprende una región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina; y

(b) un antígeno,

en la que el polipéptido adyuvante se une operativa o covalentemente al antígeno

Vacunas de polipéptido de fusión de mucina, composiciones y métodos de uso de las mismas

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones y a métodos de vacunas proteicas y a su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades tales como cáncer.

Antecedentes de la invención

El epítopo de hidrato de carbono a-Gal (Gala1, 3Ga11, 4GlcNAc11-R) se expresa en todo el reino animal, con la notable excepción de los monos, simios y seres humanos del Viejo Continente. Estas especies carecen del epítopo debido a una mutación inactivante en el gen que codifica para la a1, 3-galactosiltransferasa responsable de su biosíntesis. En los animales en los que está presente, se porta tanto por lípidos como en una variedad de proteínas transportadoras. Las especies que carecen del epítopo, por ejemplo seres humanos, tienen anticuerpos que reconocen a-Gal, posiblemente como resultado de una respuesta inmunitaria contra los polisacáridos capsulares bacterianos de la microflora intestinal. Los anticuerpos anti-a-Gal (anti-Gal) son de todas las clases y subclases de anticuerpos, y hasta el 1% de la IgG humana tiene esta especificidad.

Las mucinas tales como MUC1, y moléculas similares a mucinas con dominios altamente O-glicosilados, tales como ligando 1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) , son proteínas de alto peso molecular (> 200 kD) extensamente glicosiladas y son dianas para la a1, 3-galactosiltransferasa. Las mucinas se expresan abundantemente en células normales tales compuesto leucocitos y en muchos cánceres humanos de origen epitelial.

El documento WO98/4275 da a conocer proteínas de fusión antigénicas que portan múltiples epítopos Gala1, 3Gal para la eliminación de anticuerpos foráneos, tales como anticuerpos humanos xenorreactivos anti-cerdo, mediante absorción.

La Temple, D.C. y Galili U. (1999) Subcellular Biochemistr y , 32: 361 a 379 se refiere a potenciar la inmunogenicidad de vacunas contra el cáncer mediante anticuerpos anti-Gal mediante modificación mediante ingeniería genética de células tumorales para expresar epítopos a-gal.

Henion, T. et al (1997) Vaccine 15: 1174 a 1182 se refiere a la síntesis de epítopos a-gal en vacunas para el virus de la gripe, por a1, 3-galactosiltransferasa recombinante, con el fin de formar un complejo inmunitario con el anticuerpo anti-Gal natural.

Sumario de la invención

La invención se basa en parte en el descubrimiento de que las proteínas sustituidas con Gala1, 3Gal aumentan la inmunogenicidad de vacunas. Las mucinas que son las dianas para la a1, 3-galactosiltransferasa, son particularmente útiles en vacunas.

La invención presenta una vacuna purificada que incluye un polipéptido adyuvante y uno o más restos antigénicos. El polipéptido adyuvante incluye un primer polipéptido unido operativamente a un segundo polipéptido. El polipéptido adyuvante es un multímero tal como un dímero.

El primer polipéptido del polipéptido adyuvante incluye un polipéptido de mucina y se glicosila por una a1, 3galactosiltransferasa. Un polipéptido de mucina incluye por ejemplo, PSGL-1, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5a, MUC5b, MUC5c, MUC6, MUC11, MUC12, CD34, CD43, CD45, CD96, GlyCAM-1, MAd-CAM, una región extracelular de los mismos, o un fragmento de los mismos. El primer polipéptido contiene múltiples epítopos Gala1, 3Gal. Preferiblemente, el primer polipéptido comprende más epítopos Gala1, 3Gal que un polipéptido de ligando 1 de glicoproteína de P-selectina humano de tipo natural. El segundo polipéptido del polipéptido adyuvante incluye una región de un polipéptido de inmunoglobulina.

El antígeno es, por ejemplo, un virus, una bacteria o un hongo. Por ejemplo, el antígeno es hepatitis C, VIH, hepatitis B, virus del papiloma, malaria, tuberculosis, virus del herpes simple, clamidia o de la gripe, o, un componente biológico de los mismos tal como un péptido, proteína, lípido hidrato de carbono, hormona o combinación de los mismos. Alternativamente, el antígeno es un antígeno asociado a tumores tal como un antígeno asociado a tumores de mama; pulmón, colon, próstata, páncreas, cervicouterino o melanomas. El antígeno se une operativamente al polipéptido adyuvante. Por ejemplo, el antígeno se une covalentemente al antígeno.

El segundo polipéptido incluye una región de un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada, tal como una región Fc o una región Fab.

La presente invención se refiere además a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido adyuvante, a un vector que incluye este ácido nucleico aislado, y a una célula que comprende este vector. El vector contiene además un ácido nucleico que codifica para el polipéptido antigénico.

La descripción también presenta métodos de inmunización. Se inmuniza un sujeto administrando a un sujeto que lo necesita una vacuna según la invención. En un aspecto adicional, la presente descripción presenta un método de prevención o alivio de un síntoma de cáncer en un sujeto identificando un sujeto que lo necesita que padece o que corre el riesgo de desarrollar cáncer y administrando al sujeto una vacuna según la invención. Por ejemplo, el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar melanoma, cáncer de mama, pulmón, colon, próstata, páncreas, cervicouterino. Un sujeto que padece o que corre el riesgo de desarrollar cáncer se identifica mediante métodos conocidos en la técnica para el trastorno particular.

La descripción también presenta métodos de aumento de la secreción de anticuerpos o la activación de célula inmunitaria poniendo en contacto una célula con una vacuna según la invención. La célula es una célula B o una célula T.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o la prueba de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, predominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos sólo son ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western de proteínas PSGL-1/mIgG2b sustituidas con 1, 3-gal. SDS-PAGE al seis por ciento de proteínas aisladas de sobrenadantes de células COS transfectadas con vector solo (CDM8) , PSGL-1/mIgG2b o PSGL-1/mIgG2b y plásmidos de expresión de a1, 3-GT porcina. Se usaron perlas de agarosa-IgG anti-ratón para la purificación por inmunoafinidad de proteínas de fusión. Tras un lavado extenso, se llevaron a ebullición las perlas en tampón de muestra en condiciones reductoras y no reductoras para liberar las proteínas absorbidas. Geles que se hicieron correr en paralelo o bien se tiñeron con plata, o bien se usaron para la transferencia electroforética de proteínas separadas sobre membranas de nitrocelulosa. Éstas se trataron con sonda posteriormente con la lectina isolectina B4 de Bandeireia simplicifolia conjugada con peroxidasa y se visualizaron mediante quimioluminiscencia para detectar epítopos Gala1, 3Gal en proteínas inmunopurificadas. La longitud de la migración en el gel de proteínas de peso molecular de 220, 97 y 66 kDa se indica en el lado izquierdo.

La figura 2 es un gráfico que demuestra la cuantificación mediante ELISA de Fc de IgG anti-ratón de la concentración de la proteína de fusión de PSGLl/mIgG2b en volúmenes crecientes de sobrenadantes de células COS transfectadas antes y después de la absorción en 50 !l de perlas de agarosa-IgG anti-ratón. Se analizaron muestras por triplicado.

La figura 3 es un gráfico que demuestra la citotoxicidad de células PEC-A mediada por el complemento, dependiente de anticuerpos mediante diferentes volúmenes de suero AB humano tras la absorción en 50 !l de perlas de agarosa-IgG anti-ratón que portaban aproximadamente 300 ng de PSGL-1/mlgG2b sustituida con Gal-a1, 3Gal o no sustituida tal como se estimó en un ensayo de liberación de 51Cr.

La figura... [Seguir leyendo]

1. Vacuna purificada que comprende:

(a) un polipéptido adyuvante que comprende un primer polipéptido unido a un segundo polipéptido,

en la que el primer polipéptido es un polipéptido de mucina y se glicosila por una a1, 3-galactosiltransferasa y el segundo polipéptido comprende una región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina; y

(b) un antígeno, en la que el polipéptido adyuvante se une operativa o covalentemente al antígeno.

2. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el primer polipéptido se selecciona del grupo que consiste en PSGL-1, MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC5a, MUC5b, MUC5c, MUC6, MUC11, MUC12, CD34, CD43, CD45, CD96, GlyCAM-1, MAdCAM, o un fragmento de los mismos.

3. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el primer polipéptido comprende al menos una región de un ligando 1 de glicoproteína de P-selectina.

4. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el primer polipéptido incluye una parte extracelular de un ligando 1 de glicoproteína de P-selectina.

5. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el primer polipéptido comprende los aminoácidos 19-319 del ligando 1 de P-glicoproteína humana.

6. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el primer polipéptido comprende múltiples epítopos Gala1, 3Gal.

7. Vacuna según la reivindicación 4, en la que el primer polipéptido tiene el 60% o más de su masa debida al glicano.

8. Vacuna según la reivindicación 4, en la que el primer polipéptido tiene el 80% o más de su masa debida al glicano.

9. Vacuna según la reivindicación 4, en la que el primer polipéptido tiene el 90% o más de su masa debida al glicano.

10. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el polipéptido adyuvante es un dímero.

11. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en virus de la hepatitis C, VIH, virus de la hepatitis B, virus del papiloma, malaria, tuberculosis, virus del herpes simple, clamidia y de la gripe, o un componente biológico de los mismos.

12. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno asociado a tumores.

13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que el antígeno asociado a tumores se selecciona del grupo que consiste en antígenos asociados a tumores de mama, pulmón, colon, próstata, páncreas, cervicouterino y melanomas.

14. Ácido nucleico aislado que codifica para la vacuna según la reivindicación 1.

15. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Célula que comprende el vector según la reivindicación 15,

17. Vacuna según la reivindicación 1, que comprende además un compuesto adyuvante.

18. Uso de la vacuna según la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para inmunizar un sujeto humano que corre el riesgo de desarrollar cáncer.

19. Uso de la vacuna según la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para la administración en una dosis eficaz para prevenir o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto afectado por cáncer.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que dicho cáncer se selecciona de mama, pulmón, colon, próstata, páncreas, cervicouterino y melanoma.

21. Método in vitro de aumento de la secreción de anticuerpos en una células B, que comprende poner en contacto dicha célula con la vacuna purificada según la reivindicación 1, de manera que se aumenta la secreción de anticuerpos en dicha célula.

22. Método según la reivindicación 21, en el que se aumenta la secreción de anticuerpos en dicha célula directamente estimulando células B o indirectamente estimulando células T.

23. Método in vitro de aumento de la activación de célula inmunitaria que comprende poner en contacto dicha célula inmunitaria con la vacuna purificada según la reivindicación 1, de manera que se aumenta la 10 activación de dicha célula.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula B y una célula T.

25. Vacuna purificada según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección viral, bacteriana o fúngica o en el tratamiento de un sujeto que padece o que corre el riesgo de desarrollar cáncer.