VACUNA CANINA PARA LA PROTECCIÓN CONTRA LA ERLIQUIOSIS.

Una composición de vacuna que comprende: una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis,

en la que dichas cepas de bacterina inactivada comprenden Ehrlichia canis Ebony y Ehrlichia canis Broadfoot, un excipiente farmacológicamente aceptable, y una cantidad inmunogénicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por células

Vacuna canina para la protecci6n contra la erliquiosis Antecedentes de la invención La erliquiosis canina es una enfermedad letal producida por Ehrlichia canis (E. canis) , un pat6geno intracelular transmitido por la sangre y que infecta a todas las razas de perros en cualquier fase de crecimiento. La erliquiosis canina la transmite principalmente la garrapata marr6n del perro, Rhipicephalus sanguineous, que se cree que es el reservorio principal de la enfermedad. La erliquiosis canina es una enfermedad posiblemente letal que es endemica de los Estados Unidos y que aparece en todo el mundo. Los sintomas normalmente progresan desde una patologia aguda a cr6nica dependiendo de la cepa del organismo y del estado inmune del huesped. En casos agudos, los sintomas incluyen secreci6n nasal y ocular mucopurulenta, deshidrataci6n, hiperplasia reticuloendotelial, fiebre, linfoadenopatia generalizada, esplenomegalia y trombocitopenia. En casos cr6nicos, pueden producirse sintomas variables de anorexia, depresi6n, perdida de estamina, rigidez y reticencia a caminar, edema en las extremidades o en el escroto, y tos o disnea.

Actualmente no existe ninguna vacuna disponible para el tratamiento o la prevenci6n que sea eficaz contra la erliquiosis canina. El tratamiento habitual para todas las formas de erliquiosis es la administraci6n de un antibi6tico, tal como tetraciclina, durante un minimo de 2 semanas para casos agudos, o de 1-2 meses en casos cr6nicos. En casos cr6nicos, las anomalias hematol6gicas pueden persistir durante 3-6 meses, o de por vida. Puede ser necesaria una terapia complementaria para combatir el desgaste y disfunci6n de 6rganos especificos. Claramente, se preferiria la prevenci6n eficaz de la enfermedad en un regimen con antibi6ticos post-infecci6n.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invenci6n proporcionar una composici6n de vacuna segura y eficaz, util inducir inmunoprotecci6n contra la erliquiosis canina en perros.

Es otro objeto de la presente invenci6n proporcionar un procedimiento para la prevenci6n o mejora de la erliquiosis canina en perros.

Es un objeto adicional de la presente invenci6n proporcionar un procedimiento para inducir la erliquiosis canina en 25 un animal de ensayo. Dicho procedimiento es util para evaluar y estudiar las defensas del huesped y los mecanismos pat6genos y para mejorar el desarrollo de vacunas contra la erliquiosis.

Es una caracteristica de la presente invenci6n que la composici6n de vacuna pueda proteger a los perros contra multiples cepas de E. canis que se originan en una diversidad de regiones geograficas.

Es otra caracteristica de la presente invenci6n que la inmunoprotecci6n eficaz contra la erliquiosis canina pueda 30 impartirse a perros de cualquier edad.

Otros objetos y caracteristicas de la invenci6n seran evidentes a partir de la descripci6n detallada que se expone a continuaci6n en el presente documento.

Sumario de la invención La presente invenci6n proporciona una composici6n de vacuna segura y eficaz, que comprende: una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis en la que dichas cepas de bacterina inactivadas comprenden Erlichia canis ebony y Erlichia canis broadfoot un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas (IMC) .

La presente invenci6n tambien proporciona un procedimiento para la prevenci6n o mejora de erliquiosis canina en 40 perros.

Descripción detallada de la invención El agente causante de la erliquiosis canina es Ehrlichia canis (E. canis) , una bacteria gram-negativa del orden Rickettsiales, que aparece individualmente o en inclusiones compactas en leucocitos circulantes de mamiferos y que se trasmite por garrapatas. La erliquiosis canina es endemica en muchas partes de Estados Unidos y se sabe que 45 aparece en todo el mundo. La erliquiosis canina aguda, de origen natural, simula la fiebre maculosa de las Montafas Rocosas. Los casos mas graves se producen en los meses mas calientes, lo que coincide con la mayor actividad del vector de la garrapata. La erliquiosis canina puede ser una enfermedad letal. Muy a menudo es una enfermedad cr6nica que puede afectar a un perro de cualquier edad, produciendo sintomas variables, tales como anorexia, depresi6n, perdida de estamina, rigidez y reticencia a caminar, edema de las extremidades o del escroto, tos o 50 disnea. Hasta el momento, no se conocen tratamientos de vacunaci6n o de inmunizaci6n eficaces disponibles contra la erliquiosis canina.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que una composici6n de vacuna, que comprende una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de E. canis en la que dichas cepas de bacterina inactivadas comprenden Erlichia canis ebony y Erlichia canis broadfoot, un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas (IMC) , puede administrarse a perros en cualquier etapa de crecimiento para prevenir o mejorar la erliquiosis canina, preferentemente a las 18 semanas de vida o mas.

La bacterina de E. canis adecuada para su uso en la composici6n de vacuna de la presente invenci6n puede ser de una o mas cepas, tales como las denominadas cepa Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venezuela, la cepa Jake de la Universidad del Estado de Carolina del norte (NCSU) , los aislados Demon, DJ y Fuzzy de la NCSU, lineas celulares infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas designadas, lineas celulares DH82 infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas designadas o las lineas celulares DH82 infectadas por E. canis depositadas en la Colecci6n Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD) , y con el numero de acceso CRL 10390 proporcionado, segun se desvela en la patente de Estados Unidos numero 5.192.679, o similar. Una bacterina de E. canis adecuada para su uso en la composici6n de vacuna de la presente invenci6n puede ser preferentemente de dos cepas de E. canis, tales como Ebony y Broadfoot.

La cepa Ebony, por ejemplo, tiene una homologia del 99, 9 por ciento con la cepa Oklahoma basada en la secuencia de ADN recombinante (ADNr) 16S (es decir, una diferencia de un nucle6tido) [Mathew JS y col., Attempted transmission of Ehrlichia canis by Rhipicephalus sanguineus afterpassage incell culture, Am J Vet Res nov.1998; 57 (11) :1594-8], y se ha demostrado que la garrapata marr6n del perro, (Rhipicephalus sanguineus) (Mathew 1996) , en estado ninfa y adulto, puede transmitirla a los perros.

Se ha desvelado que la cepa Florida, contiene un gen principal de proteina inmunorreactiva de 28 kDa conservado (Patente de Estados Unidos N° 8.458.942) y un gen p-30 que pertenece a la familia de genes multiples omp-1 (Patente de Estados Unidos N° 6.432.649) . Por otra parte, la Patente de Estados Unidos N° 6.043.085 desvela que la cepa Florida tiene una proteina antigenica inmunodominante de 120 kDa, que contiene 14 repeticiones con 36 aminoacidos cada una, que se supone que esta expuesta en la superficie. Las unidades de repetici6n son hidr6filas y forman el nucleo de las regiones de la proteina expuestas a la superficie y son ricas en serina y en acido glutamico. Cada serina y acido glutamico comprenden el 19% de los aminoacidos de una unidad de repetici6n. Se cree que la cepa Florida es menos virulenta que la cepa Jake de la NCSU de E. canis [Breitschwerdt y col. Doxycycline hyclate treatment of experimental canine Erliquiosis followed by challenge inoculation with two Ehrlichia canis strains, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, feb 1998; 42 (2) :362-68], mientras que la comparaci6n serol6gica con la cepa Oklahoma revel6 una especificidad del 100% y una sensibilidad del 87, 5 % [Dawson JE y col. Serologycal comparison of human erliquiosis using two Ehrlichia canis isolates. J Infect Dis. mar 1991; 163 (3) :5647].

Ademas de ser cultivadas en una linea celular canina continua (por ejemplo, DH82) (Keysar y A y col. The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel, Vet Parasitol abril 1996; 62 (34) : 331-40.) , la cepa Israel 611 se ha cultivado en una linea celular macr6faga continua de rat6n (por ejemplo, J774.A1) (Keysar y A y col. Cultivation of Ehrlichia canis in a contionuous BALB/c mouse macrophage cell culture... [Seguir leyendo]

1. Una composici6n de vacuna que comprende: una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis, en la que dichas cepas de bacterina inactivada comprenden Ehrlichia canis Ebony y Ehrlichia canis Broadfoot, un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas

2. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que dicha bacterina inactivada se combina con una o mas cepas de E. canis denominadas Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venezuela, la cepa Jake de la Universidad del Estado de Carolina del Norte (NCSU) , los aislados Demon, DJ y Fuzzy de la NCSU, lineas celulares infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas indicadas, y una linea celular DH82 infectada por E. canis con cualquiera de las cepas indicadas.

3. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que el agente inductor de una respuesta de anticuerpos se selecciona entre el grupo que consiste en anhidrido maleico de etileno, emulsiones de latex de un copolimero de estireno con una mezcla de acido acrilico y metacrilico, copolimero acrilico de estireno, hidr6xido de aluminio o similar, y una mezcla de los mismos.

4. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que el agente inductor de una respuesta inmunitaria mediada por celulas se selecciona del grupo que consiste en una emulsi6n de aceite en agua, una composici6n de escualano con Tween® 80 y copolimeros de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una composici6n del analogo de treonilo del dipeptido muramilico con Tween® 80 y copolimeros de escualano y copolimeros de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una Mycobacterium bovis atenuada, el bacilo de Calmette-Guerin, citocinas relacionadas con Th1, interleucina-12 (IL-12) , interleucina-18 (IL-18) , interfer6n gamma, y una mezcla de los mismos.

5. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en la que dicha bacterina inactivada esta presente en una cantidad suficiente para proporcionar al menos 1x104 de DICT50 por dosis unitaria.

6. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, en la que el agente inductor de una respuesta de anticuerpos es una mezcla de anhidrido maleico de etileno y de un copolimero acrilico de estireno que esta presente en la cantidad de aproximadamente 1% vol/vol de anhidrido maleico de etileno y aproximadamente 3% vol/vol de copolimero acrilico de estireno.

7. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicha emulsi6n de aceite en agua se selecciona del grupo que consiste en una emulsi6n de aceite de parafina en agua, una emulsi6n que comprende escualano y un copolimero de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una emulsi6n que comprende escualano y un copolimero de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno con el analogo de treonilo del dipeptido muramilico, y una mezcla de los mismos.

8. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que adicionalmente comprende una bacterina de Borrelia burgdoferi.

9. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicho agente de respuesta inmunitaria mediada por celulas es una emulsi6n de aceite en agua y esta presente en un intervalo de aproximadamente el 3% al 7% vol/vol.

10. La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicho agente de respuesta inmunitaria mediada por celulas es una emulsi6n de aceite en agua y esta presente en una cantidad de aproximadamente el 5% vol/vol.

11. Una composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la prevenci6n o mejora de erliquiosis canina en un perro.