VACUNA ANTITUMORAL DERIVADA DE CELULAS CD4+ NORMALES MODIFICADAS QUÍMICAMENTE.

Vacuna antitumoral derivada de células CD4+ normales modificadas químicamente Campo de la invención La invención se refiere principalmente a composiciones adecuadas para inducir respuestas inmunes contra tumores malignos; por lo tanto, las composiciones pueden usarse como vacuna o para generar células citotóxicas para una inmunoterapia adoptiva. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de una vacuna antitumoral celular basada en el uso de solamente células normales del sistema inmune. Antecedentes de la invención Los cánceres avanzados representan una de las causas principales de muerte en seres humanos, pero no se han sugerido hasta ahora procedimientos de tratamiento totalmente eficaces. Las inmunoterapias basadas en células representan el procedimiento no tóxico más prometedor de tratamiento del cáncer. La inmunoterapia del cáncer tiene como objetivo destruir las células tumorales por mecanismos inmunológicos. Puede usarse como un único tratamiento, o como un adyuvante para otros tipos de terapias tales como, por ejemplo, cirugía, irradiación y quimioterapia. La estrategia se basa en la manipulación ex vivo y la reintroducción de productos celulares para evitar inmunocompetencias con el fin de inducir respuestas inmunes específicas de tumores. Por lo tanto, el objetivo final de dichas inmunoterapias basadas en células es la inducción de células efectoras específicas de tumores y los avances recientes se han centrado en linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) capaces de reconocer y destruir células tumorales. Es importante que estos CTL deberían ser capaces de sobrevivir durante un tiempo prolongado en el organismo en forma de células de memoria que puedan reactivarse y expandirse rápidamente tras la reaparición de células tumorales en el organismo. La posibilidad de emplear el sistema inmune para atacar células cancerosas viene del hecho de que las células cancerosas contienen nuevas proteínas o sobreexpresan las proteínas existentes que pueden convertirse en dianas para el ataque inmunológico. Se han identificado un número significativo de antígenos asociados a tumores reconocidos por dichos CTL desde la descripción del primer antígeno tumoral humano MAGE-1 en 1991 por el grupo de T. Boon (Novellino y col., 2005). Actualmente hay tres grupos principales de antígenos tumorales bajo investigación intensiva como posibles dianas para una inmunoterapia activa: (i) antígenos de diferenciación tales como MART-1, gp100 y tirosinasa para melanomas, y PSA y PSMA para el cáncer de próstata; (ii) antígenos sobreexpresados tales como telomerasa y survivina y (iii) antígenos de cáncer/testículo (CTA) tales como MAGE, GAGE, NY-ESO-1 y BORIS. Desde el punto del direccionamiento específico de respuestas inmunes a células tumorales, los de mayor perspectiva son los CTA, ya que no se expresan en células normales excepto en células germinales del testículo que no son reconocidas por el sistema inmune (las células germinales carecen de expresión de moléculas de histocompatibilidad) (véanse las revisiones sobre CTA: (Kirkin y col., 2002; Zendman y col., 2003)). Se demostró que la activación de CTA en células tumorales es debida a la desmetilación del promotor en regiones de CpG y es una consecuencia de un procedimiento de desmetilación de todo el genoma que se produce en muchos cánceres, y se correlaciona con progresión tumoral (De Smet y col., 1996). De hecho, se demostró que la expresión de CTA estaba asociada con progresión tumoral (Brasseur y col., 1995; Eura y col., 1995; Katano y col., 1997; Patard y col., 1995). Los potenciales terapéuticos de este grupo de antígenos tumorales se han confirmado por varios estudios. Por ejemplo, (a) un paciente con melanoma MZ-2 con metástasis que se sometió a múltiples vacunaciones con células tumorales autólogas destruidas conduciendo al desarrollo de respuestas de CTL contra varios CTA (MAGE-1, MAGE-3, GAGE y BAGE, véase la revisión (van Pel y col., 1995)) experimentó un periodo sin enfermedad de larga duración (P. Coulie, comunicación personal); (b) la vacunación de pacientes con melanoma con células dendríticas cargadas con péptido de MAGE-A3 indujo la regresión de metástasis positivas a antígeno (Thurner y col., 1999a); y (c) la eficacia terapéutica de una vacuna polivalente estaba correlacionada con la inducción de una respuesta inmune contra el antígeno MAGE-3 (Reynolds y col., 2003). No obstante, debido a la elevada heterogeneidad en la expresión de miembros de CTA separados, este grupo de antígenos no es popular como diana inmunológica en comparación con antígenos de diferenciación o sobreexpresados. Para superar el problema con la expresión heterogénea de CTA, las vacunas que se dirigen a estos antígenos deberían ser tan polivalentes como fuera posible. La solicitud de patente WO 03/045427 describe una vacuna polivalente que se dirige a CTA de este tipo que está basada en una línea celular de melanoma humano preseleccionada que expresa altos niveles de CTA y que no expresa antígenos de diferenciación de melanocitos. Todas las demás vacunas basadas en células tumorales emplean tumores autólogos, o líneas celulares convencionales seleccionadas basándose en el principio de que "cuantos más antígenos tumorales diferentes mejor". El empleo de células tumorales autólogas en una vacuna como fuente de antígenos puede inducir en algunos casos la regresión del tumor, cuando se aplica en forma de vacunación basada en células dendríticas (O'Rourke y col., 2003; Marshall y col., 2006). La limitación principal de la estrategia de vacuna polivalente es la dificultad en la producción y normalización de la mezcla antigénica. El uso directo de material de biopsia original carece de normalización y además también con frecuencia dicho material no está disponible. El uso de líneas celulares convencionales no ha demostrado una alta eficacia clínica hasta ahora (Palucka y col., 2006; Salcedo y 2 E08701232 25-11-2011   col., 2005). Una de las razones para la baja eficacia de uso de material de célula tumoral completa es la baja eficacia de presentación cruzada. Para estimular la generación de las células T citotóxicas, los antígenos proteicos tumorales exógenos tienen que captarse por células presentadoras de antígeno a través del proceso de endocitosis y después transferirse de las vesículas endocíticas al citosol (véase la revisión (Cresswell y col., 2005)). Esto es necesario para el procesamiento de antígenos proteicos y la formación de péptidos antigénicos. Más adelante, los péptidos se presentan en la superficie en asociación con moléculas de MHC clase I. Sólo una pequeña porción de los antígenos añadidos exógenamente entra en la célula y sólo una pequeña fracción de la proteína captada después de eso se somete a presentación cruzada. Para superar la baja eficacia de presentación cruzada, varios autores sugirieron el uso de ARN aislado de células tumorales para la transfección de células presentadoras de antígenos (Gilboa y Vieweg, 2004; Schaft y col., 2005; Kyte y col., 2006). El factor limitante principal de la transfección con ARN es la ausencia de formación de complejos de péptidos antigénicos y moléculas de MHC clase II que es necesaria para la inducción de una respuesta auxiliar T. Sin respuesta auxiliar T no está teniendo lugar ninguna formación de memoria inmunológica CD8+ (Bevan, 2004; Castellino y Germain, 2006), y sin formación de memoria, los CTL CD8+ mueren después de la expansión inicial. Además, en condiciones de crecimiento tumoral, la formación de una respuesta de memoria de CD8+ puede estar corrompida debido a la presencia de células reguladoras (Klebanoff y col., 2006). Se ha sabido que la 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) induce la expresión de antígenos de cáncer/testículo principalmente en células tumorales (Weber y col., 1994). Además, se demostró previamente por un grupo (De Smet y col., 1996) pero no por otro (Weber y col., 1994) que la 5-Aza-CdR también podría inducir la expresión de al menos uno de CTA, MAGE-A1, en linfocitos de sangre periférica activados con PHA. Esta técnica se usa en la solicitud de patente WO 03/012086 como parte de un procedimiento de generación de células presentadoras de antígeno que comprende recoger células de un sujeto, activar las células con agentes tales como mitógeno de hierba carmín (PWM) y fitohemaglutinina (PHA), cultivar las células activadas ex vivo, y tratar las células cultivadas con agentes de hipometilación del ADN de modo que las células expresen múltiples antígenos asociados a tumores (CTA). Los CTA producidos de este modo se proponen para su uso como vacunas contra el cáncer. Sin embargo, una cuestión principal en este procedimiento es el uso de agentes extraños tales como mitógeno de hierba carmín (PWM) y... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de una composición de presentación de antígenos enriquecida en células CD4+, que comprende estimular la proliferación de células linfoides inactivadas normales usando células dendríticas maduras normales que no se han cargado con antígenos contra los que debería dirigirse la reacción inmune que se va a inducir, y tratar químicamente las células en proliferación con agentes que inducen la desmetilación del ADN o la acetilación de histonas, para inducir la expresión de antígenos de cáncer/testículo. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células linfoides son linfocitos de sangre periférica extraídos de sangre heteróloga o autóloga. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que los antígenos se han inducido durante la fase logarítmica de proliferación. 4. Un procedimiento de preparación de una composición citotóxica, que comprende preparar una composición de presentación de antígenos por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y usar la composición de presentación de antígenos para activar linfocitos de células T activados, obteniendo de este modo una composición citotóxica que contiene linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores. 5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el número de linfocitos de células T se expande después de la activación mediante el uso de células dendríticas maduras. 6. Una composición para inducir una respuesta inmune en un mamífero, que comprende células linfoides en las que la expresión de antígenos de cáncer/testículo se ha inducido químicamente por metilación del ADN o acetilación de histonas después de la activación con células dendríticas maduras normales que no se han cargado con antígenos contra los que debería dirigirse la reacción inmune que se va a inducir. 7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que las células linfoides son linfocitos, preferentemente linfocitos de sangre periférica. 8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la que los antígenos se han inducido durante la fase logarítmica de proliferación. 9. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en la que los linfocitos que expresan antígenos incluyen células CD4+. 10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que la desmetilación del ADN comprende el tratamiento con 5-aza-2-desoxicitidina o un inhibidor de la desacetilación de histonas. 11. Una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y un vehículo aceptable. 12. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para la preparación de una vacuna para la estimulación de una respuesta inmune contra los antígenos tumorales. 13. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 como células presentadoras de antígenos para la activación de linfocitos T citotóxicos. 14. Un procedimiento de preparación linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores que comprende activar linfocitos T usando una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 como células presentadoras de antígenos. 15. Uso de linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores obtenidos por el procedimiento de la reivindicación 14 para la preparación de una composición farmacéutica para la inmunoterapia adoptiva de células T. 16 E08701232 25-11-2011   17 E08701232 25-11-2011   18 E08701232 25-11-2011   19 E08701232 25-11-2011   E08701232 25-11-2011   21 E08701232 25-11-2011   22 E08701232 25-11-2011   23 E08701232 25-11-2011   24 E08701232 25-11-2011   E08701232 25-11-2011   26 E08701232 25-11-2011