Un método que comprende:

(a) seleccionar una primera planta y una segunda planta,

en donde la primera planta y la segunda planta pueden cruzarse para producir una planta progenie fértil que presente un fenotipo relacionado con heterosis en comparación con las plantas parentales;

(b) detectar variaciones estructurales de ADN entre un genoma de la primera planta y un genoma de la segunda planta; y,

(c) relacionar las variaciones estructurales con el fenotipo relacionado a heterosis usando una estrategia computacional evolucionaria iterada, identificando con ello las variaciones estructurales que predicen el grado esperado del fenotipo relacionado a heterosis en la planta progenie;

en donde, en la etapa (b),

(i) las variaciones estructurales son detectadas usando un método de hibridación genómica comparativo; o

(ii) las variaciones estructurales son variaciones del número de copia.

Uso de una variación estructural para analizar diferencias genómicas para la predicción de heterosis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas y al cultivo de plantas, particularmente a la predicción del grado de fenotipos heteróticos en plantas.

ANTECEDENTES

La producción agrícola ha aumentado drásticamente durante la segunda mitad del siglo veinte. Una gran parte de este aumento se ha atribuido al desarrollo y al uso de variedades de semillas híbridas en cultivos básicos como el maíz, el sorgo, el girasol, la alfalfa, la canola y el trigo. El éxito de las variedades de semillas híbridas se debe a un fenómeno denominado heterosis, por el cual las plantas híbridas presentan un fenotipo más deseable que cualquiera de las dos líneas originales usadas para producir la planta híbrida. La heterosis se ha observado en una serie de rasgos vegetales que incluyen el rendimiento, la altura de la planta, la biomasa, la resistencia a enfermedades e insectos, la tolerancia al estrés, y otros. Estos rasgos heteróticos son de naturaleza poligénica, lo que da como resultado su rango característico de fenotipos, en lugar de los fenotipos mendelianos discretos tradicionales. La naturaleza poligénica de los rasgos da como resultado estructuras complejas de herencia, de tal modo que los componentes subyacentes en los fenotipos heteróticos observados todavía son cuestión de debate en la comunidad de la ciencia de las plantas.

Debido al valor económico de la heterosis, ha habido varios intentos para usar técnicas de biología molecular con el objetivo de aumentar los programas de cultivo de plantas híbridas tradicionales. El grueso de los esfuerzos se ha centrado bien en el ARNm (ARN mensajero) o bien en el ADN genómico. La estrategia de ARNm es extremadamente difícil ya que las comparaciones requieren muestras de tejido seleccionadas de la misma porción de la planta, en el mismo tiempo de desarrollo y en las mismas, o muy similares, condiciones ambientales. El proceso se complica aún más ya que el investigador necesita determinar que porción de la planta o qué etapa de desarrollo dará lugar a los mejores resultados para predecir el grado de un fenotipo heterótico particular de interés. Como consecuencia de estas implicaciones, las predicciones basadas en ARNm frecuentemente tienen niveles elevados de ruido y presentan una baja precisión en la predicción del grado de un fenotipo heterótico.

El uso de ADN genómico para predecir el grado de uno o más fenotipos heteróticos ha sido igualmente decepcionante. Los esfuerzos iniciales usaron hibridación sustractiva o hibridación in situ fluorescente a fin de identificar diferencias de número de copia en líneas de plantas cultivadas. Estas técnicas no producen resultados fácilmente cuantificables y sólo pueden detectar diferencias grandes en los números de copia, tal como una doblado o una eliminación completa. Esto es un problema significativo en plantas poliploides, ya que las duplicaciones cromosomales y otros eventos evolucionarios han dado como resultado genes con copias múltiples, algunos de los cuales son seudogenes, a lo largo de todo el genoma de la planta. Estos números de copia más altos reducen enormemente la utilidad de las estrategias de ADN genómico, puesto que son incapaces de detectar de formar precisa la adición o la eliminación de una copia sencilla de un gen representado tres o más veces en el genoma.

Otra estrategia genómica ha sido el uso de marcadores genéticos para predecir la heterosis. En estas técnicas se han usado marcadores RFLP, así como otros marcadores tradicionales. Los investigadores han intentado usar marcadores genéticos para predecir el grado de un fenotipo heterótico con algo de éxito, siempre que las plantes madre potenciales pertenezcan a los mismos grupos heteróticos que se usaron en los cruces iniciales para generar los datos de correlación en los que se basa la predicción. Una vez que se usan plantas de otros grupos heteróticos, la capacidad predictiva de fenotipo heterótico de los marcadores genéticos disminuye enormemente. La razón de la pérdida de capacidad predictiva ha sido atribuida a un enlace insuficiente de los marcadores a sitios de rasgos cuantitativos que controlan el rasgo de interés, y a una carencia de desequilibrio de enlace de fase gamética entre el marcador y alelos de sitio de rasgo cuantitativo. Esta reducción de la capacidad predictiva limita gravemente el uso de marcadores genéticos en los programas de cultivo de plantas.

En base a estos esfuerzos, la aplicación de técnicas de biología molecular para la predicción del grado de un fenotipo heterótico ha sido como mínimo problemática. A pesar de los años de investigación, todavía no se ha desarrollado un método satisfactorio.

La Hibridación de Genoma Comparativa (CGH, en sus siglas en inglés) es una técnica que ha sido empleada para estudiar anormalidades cromosomales en células de animales. Un área principal de uso de la CGH ha sido el análisis de mutaciones de cáncer en un esfuerzo para identificar mejor células cancerígenas con el objetivo de seleccionar cursos de terapia más efectivos. La CGH es particularmente efectiva en células animales ya que hay normalmente dos copias de cada gen en el genoma (una de cada padre) . Adicionalmente, actualmente se conocen genomas completos de mamíferos. Los investigadores han sido capaces de aprovechar la baja duplicación y la información de secuencia de genoma para identificar regiones cromosomales duplicadas y eliminadas. Esta información se puede usar después para identificar los cambios que han transformado células normales en células cancerosas. Sin embargo, en la actualidad se desconoce la secuencia de genoma completa de varios cultivos principales. Como resultado, se ha hecho poco uso de la CGH en plantas y hacerlo requiere superar las numerosas diferencias que surgen cuando se trabaja con genómica de plantas.

RESUMEN

La presente invención se refiere al uso de análisis de variación estructural del genoma, tal como el análisis de variación del número de copias, detectado por ejemplo mediante el uso de hibridación genómica comparativa, para predecir el grado de una progenie de fenotipo heterótico en plantas. En un aspecto de la invención, se ponen en contacto grupos de moléculas sonda de oligonucleótidos y ADN genómico de planta y la mezcla resultante de sondas hibridadas y ADN genómico se analiza para determinar las sondas que muestran niveles de hibridación diferentes entre dos padres diferentes. A continuación los resultados se usan para predecir el grado de un fenotipo heterótico de plantas progenie derivadas de las dos líneas parentales. El grado predicho de un fenotipo heterótico puede usarse en el desarrollo de plantas híbridas. Se puede seleccionar un subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótidos que son buenas predictoras del grado de un fenotipo heterótico a partir de una población mayor de moléculas sonda de oligonucleótidos, y el subconjunto seleccionado puede usarse entonces en ensayos futuros para predecir el grado de un fenotipo heterótico.

Por consiguiente, la invención proporciona un método que comprende:

(a) seleccionar una primera planta y una segunda planta, en donde la primera planta y la segunda planta pueden cruzarse para producir una planta progenie fértil que presente un fenotipo relacionado con heterosis en comparación con las plantas parentales;

(b) detectar variaciones estructurales de ADN entre un genoma de la primera planta y un genoma de la segunda planta; y

(c) relacionar las variaciones estructurales con el fenotipo relacionado a heterosis usando una estrategia computacional evolucionaria iterada,

identificando con ello las variaciones estructurales que predicen el grado esperado del fenotipo relacionado a heterosis en la planta progenie;

en donde, en la etapa (b) ,

(i) las variaciones estructurales son detectadas usando un método de hibridación genómica comparativo; o

(ii) las variaciones estructurales son variaciones del número de copias.

La invención también proporciona un método para desarrollar un sistema de oligonucleótidos para la predicción de un fenotipo relacionado a heterosis en una planta que comprende:

(a) seleccionar una pluralidad de líneas parentales en las que se ha cuantificado el fenotipo relacionado a heterosis en una pluralidad de los cruces F1 de dichas líneas parentales;

(b) poner en contacto ADN genómico de cada una de la pluralidad de dichas líneas parentales con una pluralidad... [Seguir leyendo]

1. Un método que comprende:

(a) seleccionar una primera planta y una segunda planta, en donde la primera planta y la segunda planta pueden cruzarse para producir una planta progenie fértil que presente un fenotipo relacionado con heterosis en comparación con las plantas parentales;

(b) detectar variaciones estructurales de ADN entre un genoma de la primera planta y un genoma de la segunda planta; y,

(c) relacionar las variaciones estructurales con el fenotipo relacionado a heterosis usando una estrategia computacional evolucionaria iterada,

identificando con ello las variaciones estructurales que predicen el grado esperado del fenotipo relacionado a heterosis en la planta progenie;

en donde, en la etapa (b) , (i) las variaciones estructurales son detectadas usando un método de hibridación genómica comparativo; o (ii) las variaciones estructurales son variaciones del número de copia.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la planta progenie es maíz.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el método de hibridación genómica comparativa comprende:

(a) poner en contacto ADN genómico de una primera planta con una primera pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido;

(b) detectar las intensidades de hibridación correspondientes a al menos un subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido de la primera pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido;

(c) poner en contacto ADN genómico procedente de una segunda planta con una segunda pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido, en donde dichas primera y segunda pluralidades de moléculas sonda de oligonucleótido tienen al menos un subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido en común;

(d) detectar las intensidades de hibridación correspondientes a al menos un subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótidos en la segunda pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido;

(e) determinar medidas relativas de intensidad de hibridación correspondientes a una pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido individuales en dicho subconjunto común de moléculas sonda de oligonucleótido;

(f) usar dichas intensidades de hibridación relativas para predecir el grado de un fenotipo relacionado a heterosis correspondiente a una planta progenie derivada de dichas primera y segunda plantas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que:

(a) al menos una de dichas primera y segunda plantas comprende una variedad de planta cultivada; o

(b) la pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido comprende un sistema de oligonucleótidos; o

(c) dicho método comprende además seleccionar dichas primera y segunda plantas para el desarrollo de una variedad de planta híbrida F1 en base al menos en parte a dicha predicción de un fenotipo relacionado a heterosis; o

(d) las intensidades de hibridación relativas comprenden una medida de las variaciones de número de copia entre dicha primera planta y dicha segunda planta.

5. Un método para desarrollar un sistema de oligonucleótidos para la predicción de un fenotipo relacionado a heterosis en una planta que comprende:

(a) seleccionar una pluralidad de líneas parentales en las que se ha cuantificado el fenotipo relacionado a heterosis en una pluralidad de los cruces F1 de dichas líneas parentales;

(b) poner en contacto ADN genómico de cada una de la pluralidad de dichas líneas parentales con una pluralidad de moléculas sonda de oligonucleótido, en donde dichas pluralidades de moléculas sonda de oligonucleótido tienen al menos un subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido en común;

(c) detectar las intensidades de hibridación correspondientes a moléculas sonda de oligonucleótido individuales

en las pluralidades de moléculas sonda de oligonucleótido;

(d) determinar medidas relativas de intensidad de hibridación para una pluralidad de las moléculas sonda de oligonucleótido individuales en dicho subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido;

(e) seleccionar moléculas sonda de oligonucleótido que muestren intensidades de hibridación diferentes entre dichas líneas parentales;

(f) relacionar dichas intensidades de hibridación con dichas moléculas sonda de oligonucleótido seleccionadas con un fenotipo relacionado a heterosis de las plantas progenie; y

(g) crear un sistema de oligonucleótidos especializado para la predicción de un fenotipo relacionado a heterosis que comprende dichas moléculas sonda de oligonucleótido seleccionadas que se relacionan con un fenotipo relacionado a heterosis.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la planta es maíz.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que el fenotipo relacionado a heterosis es el rendimiento.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el ADN genómico comprende ADN genómico preparado.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que dichas pluralidades de moléculas sonda de oligonucleótido comprenden al menos un 50% de moléculas sonda de oligonucleótido que se hibridan con regiones codificadoras o con otras secuencias de ADN genómico no repetitivas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en el que dicho subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido común comprende al menos 100 moléculas sonda de oligonucleótido.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, en el que dicho subconjunto de moléculas sonda de oligonucleótido no contiene más de 150 moléculas sonda de oligonucleótido.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en el que dichas moléculas sonda de oligonucleótido tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, pero no más de 100.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-12, en el que dicha intensidad de hibridación relativa comprende una relación de intensidad de hibridación.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en el que se seleccionan las moléculas sonda de oligonucleótido que exhiben al menos una diferencia de tres veces, pero menos de una diferencia de diez veces, en la intensidad de hibridación.

15. El método de la reivindicación 5, en el que la etapa de selección de moléculas sonda de oligonucleótido comprende además una estrategia computacional evolucionaria iterada que comprende:

(a) formar subconjuntos de moléculas sonda de oligonucleótidos seleccionados aleatoriamente a partir de dicho subconjunto común de moléculas sonda de oligonucleótidos;

(b) determinar la capacidad de un subconjunto para predecir dicho fenotipo relacionado a heterosis en base a las intensidades relativas de los subconjuntos de oligonucleótidos;

(c) seleccionar los subconjuntos que se determine que son mejores predictores de dicho fenotipo relacionado a heterosis;

(d) formar nuevos subconjuntos combinando segmentos de los subconjuntos de intensidad predictivos mediante la adición aleatoria de nuevos oligonucleótidos procedentes del conjunto común de sondas;

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que sólo se produzcan incrementos pequeños de la capacidad predictiva de los subconjuntos o de la convergencia en la población de subconjunto predictivo;

preferiblemente en donde la capacidad de un subconjunto para predecir se analiza a través de análisis de regresión, o mediante un método de aprendizaje mecánico.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-15, en el que dicho sistema de oligonucleótidos no contiene más de 150 moléculas sonda de oligonucleótido.