Proteína Engrailed para su uso como medicamento ansiolítico.

Uso de la proteína de homeodominio Engrailed como ansiolítico.

La presente invención se refiere a la utilización de factores de transcripción Engrailed para incrementar el metabolismo dopaminérgico, y en particular como ansiolíticos.

Las proteínas Engrailed son factores de transcripción de la clase de proteínas de homeodominio. Los mamíferos poseen dos genes Engrailed: Engrailed-1 y Engrailed-2; las dos proteínas correspondientes que tienen una actividad biológica similar se designarán colectivamente en el resto del documento con el término general Engrailed (EN) .

En los recién nacidos y en adultos, EN se expresa en las neuronas dopaminérgicas (DA) de la sustancia negra (que degeneran en la enfermedad de Parkinson) , en las células granulares del cerebelo y en los núcleos dopaminérgicos del mesencéfalo que desempeñan un papel importante en la regulación del estado de ánimo y el desarrollo de conductas adictivas.

Se ha demostrado (Simon y col. J Neurosci. 21 (9) : 3126-34, 2001) que la pérdida de EN durante el desarrollo viene seguida por una rápida degeneración de las neuronas dopaminérgicas, y que una de las dianas transcripcionales de EN es la alfa-sinucleína, de la cual se ha demostrado su vinculación genética con ciertas formas familiares de la enfermedad de Parkinson (POLYMEROPOULOS y col. Science. 276, 2045-7, 1997) , y que constituiría un regulador negativo de la transmisión dopaminérgica (ABELIOVICH y col., Neuron, 25, 239-52, 2000) .

Todas estas observaciones sugieren fuertemente la participación de EN en las enfermedades neurodegenerativas, y especialmente en enfermedades que afectan a las neuronas dopaminérgicas, como la enfermedad de Parkinson. Se ha propuesto regular la actividad de EN para prevenir estas enfermedades o retrasar su evolución. Así, la Solicitud PCT WO 2004/104030 describe péptidos que modulan la actividad de Engrailed, y propone su uso para prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas.

Los inventores ahora han descubierto que, además de su actividad en la supervivencia neuronal, EN también tienen una acción directa sobre el metabolismo de la dopamina.

Se ha observado que la administración de Engrailed a ratones induce en ellos un efecto ansiolítico, que estaba acompañado por un aumento significativo en la relación DOPAC/DA, lo que refleja un incremento del metabolismo de la dopamina en el núcleo estriado, así como un aumento de la serotonina cortical.

La presente invención se refiere a la utilización de una proteína Engrailed para la obtención de un medicamento ansiolítico.

Como se ha mencionado anteriormente, en el presente documento se entiende por "proteínas Engrailed" cualquiera de las proteínas Engrailed-1 o Engrailed-2 de un vertebrado. Preferentemente, se seleccionará una proteína Engrailed de la especie a la que pertenece el sujeto a tratar.

De manera ventajosa, dicho medicamento es una preparación inyectable, preferentemente por vía intravenosa.

La presente invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos que ilustran las propiedades ansiolíticas de Engrailed, y su efecto sobre el metabolismo de la dopamina.

Ejemplo 1

Se evaluaron los efectos sobre el comportamiento de ratones de una inyección diaria de EN2 en dosis de 3 ó 300 μg/kg de la siguiente manera:

Sujetos:

Los experimentos se llevaron a cabo en ratones Swiss macho, de 6 meses.

Preparación de Engrailed-2 inyectada:

La proteína EN2 de pollo (número de acceso UniProtKB: Q05917) se produce en forma recombinante en bacterias E. coli BL21RP-CodonPlus® (Stratagene) transformadas con el plásmido pGEXSEn2, como resultado de la inserción de la secuencia codificante de EN2 completa en un plásmido pGEX-6P (Amersham-GE Healthcare) , en fusión traduccional con la secuencia que codifica para la glutatión S-transferasa (GST) .

La proteína expresada es una proteína de fusión que contiene la secuencia de la glutatión S-transferasa, seguida de un sitio de escisión para la proteasa PreScission™ (proteasa recombinante resultante de la fusión entre la GST y la proteasa 3C del rinovirus humano, Amersham-GE Healthcare) , y la secuencia completa de EN2.

Esta proteína de fusión se purificó a partir de un lisado de bacterias transformadas por cromatografía de afinidad en columna de glutatión (GSTrap, Amersham-GE Healthcare) , y la proteína EN2 se eluyó de la columna tras de la escisión con la proteasa PreScission™.

Pruebas realizadas:

Laberinto en Y: en esta prueba, el animal se sitúa en un laberinto en forma de Y. Se anota cada visita a uno de los brazos del laberinto, y el número total de visitas a uno u otro brazo, y se registra su paso de un brazo a otro. El porcentaje de alternancia entre los brazos se utiliza para evaluar la memoria de trabajo, el número total de visitas a los brazos sirve para evaluar la actividad y la evolución de esta actividad se utiliza para evaluar la habituación a corto y a largo plazo.

Rotarod: se mide el tiempo durante el cual el animal es capaz de permanecer en un cilindro en rotación, lo que permite evaluar la coordinación motora y el equilibrio.

Tail-pinch (pinzamiento de la cola) : Esta prueba mide el umbral del dolor.

Campo abierto: El animal se coloca en una cámara iluminada en una sesión de 30 minutos. La distancia recorrida y el número de erguimientos permite evaluar la actividad locomotora y exploratoria; la evolución de esta actividad entre la primera y la segunda mitad de la prueba permite evaluar la memoria de tipo habituación. Por último, la determinación del tiempo empleado y de la distancia recorrida, en el centro del recinto (que constituye un entorno estresante) sirve para evaluar el nivel de ansiedad.

El centro del campo abierto se define como un cuadrado en el centro del recinto que representa el 25% de la superficie total. Las variables índice del comportamiento de tipo ansioso son el porcentaje de tiempo empleado y el porcentaje de la distancia recorrida en el centro. El carácter estresante del centro está indicado por una conducta de evitación de confrontación con el centro, y por tanto por valores inferiores al 25% para estas dos variables. Un efecto de tipo ansiolítico de un tratamiento se manifiesta por un aumento del porcentaje de tiempo empleado y la distancia recorrida en el centro.

Laberinto en cruz elevado: se trata de un dispositivo en forma de cruz con 2 brazos abiertos y 2 brazos cerrados en los laterales. El animal se coloca en el laberinto en una sesión de 5 minutos. Se mide el número total de entradas en los 2 tipos de brazos (actividad exploratoria en un entorno estresante) , así como el porcentaje de entradas en los brazos abiertos (los más estresantes) , y el tiempo empleado en estos brazos. En la mayoría de los casos, el ratón pasa menos del 50% del tiempo y realiza menos del 50% de entradas en los brazos abiertos, lo que refleja el carácter estresante de éstos. Se considera un comportamiento de tipo ansioso aún más pronunciado cuando los porcentajes de tiempo y de entradas en los brazos abiertos son bajos. El efecto de tipo ansiolítico de un tratamiento se manifiesta por el aumento de los porcentajes de tiempo y de entradas en los brazos abiertos.

Procedimiento:

Las inyecciones se realizaron según el siguiente protocolo:

Veintiún animales se repartieron al azar en cuatro grupos que recibieron inyecciones de:

NaCl al 0, 9%: grupo control (Sal) ; (n = 10) ; EN2 3 μg/kg: grupo EN3 (n = 10) ; EN2 300 μg/kg: grupo EN300 (n = 10) .

Las inyecciones se realizan por vía intravenosa en la cola.

El calendario de las inyecciones y las pruebas es el siguiente:

Día 1: t = 0: Inyección 1

t = 1h: Laberinto en Y -Sesión 1 Día 2: t = 0: Inyección 2

t = 1h: Laberinto en Y -Sesión 2

t = 1h40: Rotarod -Sesión 1 Día 3: t = 0: Inyección 3

t = 1h: Laberinto en Y -Sesión 3

t = 1h40: Rotarod -Sesión 2 Día 4: t = 0: Inyección 4

t = 1h: Laberinto en Y -Sesión 4

t = 1h40: Rotarod -Sesión 3

t = 1h55: Tail-pinch -Sesión 1 Día 7: t = 0: Inyección 5

t = 1 h: Campo abierto t = 1h40: Rotarod -Sesión... [Seguir leyendo]

1. Proteína Engrailed para su uso como medicamento ansiolítico.

2. Proteína Engrailed para su uso según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho medicamento se presenta en forma de preparación inyectable.