UNA NUEVA SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DIRIGIDA A PLASTOS, UNA NUEVA SUCUENCIA BETA-AMILASA, UN PROMOTOR SENSIBLE A ESTÍMULOS Y USOS DE LOS MISMOS.

Una nueva secuencia de ácido nucleico dirigida a plastos, una nueva secuencia ß-amilasa, un promotor sensible a estímulos y usos de los mismos. Los mecanismos exactos mediante los cuales se sintetiza y se degrada el almidón en las plantas se desconocen, a pesar del aislamiento y caracterización de diversas enzimas que se supone que están implicadas en el proceso. El almidón se acumula en los cloroplastos de las hojas durante el día y se usa para proporcionar a las plantas las necesidades de energía y biosíntesis durante la noche. El modo mediante el cual este almidón, denominado transitorio, se moviliza no se conoce del todo, pero debe implicar la regulación coordinada de las actividades sintéticas y degradativas de las enzimas. En los tejidos foliares se piensa que la ruta de degradación principal está implicada en actividades fosforolíticas e hidrolíticas, especialmente -glucosidada (E.C. 3.2.1.3) (Nielson y Stitt, 1997). El almidón también se acumula en los amiloplastos en los órganos de almacenamiento tales como semillas, frutos y tubérculos. En este caso el almidón se almacena durante largos periodos de tiempo y la movilización del almidón está acompañada por la degeneración de los tejidos de los órganos de almacenamiento y aumenta en actividades amiolíticas y fosforolíticas. Sin embargo, existen pruebas que sugieren que la renovación del almidón también se produce en los amiloplastos de los órganos de almacenamiento (Sweetlove et al, 1996). De nuevo esto requiere la regulación coordinada de las actividades sintéticas y degradativas de las enzimas. Tanto los cloroplastos como los amiloplastos derivan de proplastos y por lo tanto tienen muchas características en común además de ser el sitio de síntesis del almidón en las hojas y en los órganos de almacenamiento respectivamente; los cloroplastos pueden transformarse en amiloplastos y en otros tipos de plastos (Thomson and Whatley, 1980). El almidón es una mezcla de dos polisacáridos: la amilosa que es una cadena lineal de unidades glucosilo unidas por enlaces -1,4-glucosídicos; y la amilopectina que está constituida por muchas cadenas lineales de -1,4poliglucanos que se unen entre sí por enlaces -1,6 glucosídicos. Las enzimas implicadas en la síntesis del almidón son la enzima ADPG fosforilasa (E.C. 2.7.7.21), la almidón sintasa (E.C. 2.4.1.21) y de ramificación (E.C. 2.4.1.18). La ADPG fosforilasa es responsable de proporcionar el sustrato ADPG, sirviendo esta molécula como donante de monómeros de glucosa que están unidos entre sí por la acción concertada de las enzimas almidón sintasas (enlaces -1,4) y de ramificación (enlaces -1,6). Se piensa que la estructura insoluble, cristalina de los granos de almidón está formada por la estrecha compactación de las moléculas de amilopectina ramificadas, prolongadas helicoidalmente, rellenando las moléculas de amilosa todos los espacios. Se ha descrito una serie de actividades enzimáticas degradativas de almidón que incluyen la enzima -amilasa (E.C. 3.2.1.1), la isoamilasa (E.C. 3.2.1.68), la ß-amilasa (E.C. 3.2.1.2), la -glucosidasa (E.C. 3.2.1.3), la almidón fosforilasa (E.C. 2.4.1.1) y la desproporcionante (E.C. 2.4.1.25). Muchas de estas actividades enzimáticas existen en formas múltiples en plantas y se piensa que algunas están implicadas en la síntesis del almidón. Todas probablemente participando, en cierta medida, en el proceso de movilización del almidón, sin embargo sus funciones exactas y posibles interacciones aun no se han determinado. Las dificultades en cuanto a la atribución de las funciones para las diferentes enzimas se ilustran mejor por referencia a dos de las actividades enzimáticas que se piensa que son las principales colaboradoras de la degradación del almidón en las plantas: la almidón fosforilasa y la amilasa. La almidón fosforilasa cataliza la liberación reversible de la glucosa-1-fosfato a partir de -1,4-glucanos. En los tejidos de las plantas se encuentran dos formas de almidón fosforilasa: la Pho1, o el tipo L, localizada dentro de los plastos y que tiene una alta afinidad hacia las maltodextrinas; la Pho2, o el tipo H, que es citosólica y tiene alta afinidad a poliglucanos grandes, muy ramificados, tales como el glucógeno. Aunque la enzima plastidial Pho1 fuese posiblemente una candidata implicada en la movilización del almidón, la inhibición antisentido de la actividad enzimática en hojas no tendría efecto sobre la acumulación del almidón en hojas de plantas de patata transgénicas (Sonnewald y col., 1995). En otro estudio, la inhibición antisentido de la Pho2 citoplásmica tuvo una influencia sobre el comportamiento germinativo de tubérculos de patatas transgénicas, pero no tuvo efecto sobre la acumulación y degradación del almidón. (Duwenig y col., 1997). Existen dos grupos principales de amilasa ambos de los cuales hidrolizan enlaces -1,4-glucosidícos en la amilosa y amilopectina: la -amilasa actúa al azar sobre enlaces no terminales, mientras que la ß-amilasa actúa para liberar unidades de maltosa a partir del extremo no reductor de la cadena de poliglucano. Se piensa que la localización subcelular de la -amilasa en el espacio apoplástico de las células de las plantas refleja el hecho de que la enzima se secreta normalmente. Sin embargo, en diversas plantas, tales como arroz (Chen, y col., 1994) y remolacha 2   azucarera (Li, y col., 1992) la enzima también se localiza dentro de los cloroplastos y amiloplastos, a pesar del hallazgo de que las secuencias de señal en el extremo amino de una serie de proteínas -amilasa son características para la translocación de las proteínas a través de la membrana de RE en lugar de la membrana plastidial (Chen y col, 1994). En un estudio en el que el promotor y la secuencia señal de un gen -amilasa del arroz se fusionaron con el gen GUS bacteriano y se introdujeron en el arroz, tabaco y patata usando transformación mediada por Agrobacterium (Chan y col., 1994), se demostró que la proteína de fusión GUS expresada se transportaba primero al retículo endoplásmico y después se exportaba al medio de cultivo de cultivos en suspensión constituidos a partir de células transgénicas. En diversos estudios, se ha observado que la -amilasa degradará moléculas de almidón nativas. En cambio, en estudios realizados in vitro se ha observado que la ß-amilasa no degradará gránulos de almidón nativos sin digestión previa de los gránulos con otras enzimas. Mutantes de arroz (Daussant y col., 1981) y de soja (Hildebrand e Hymowitz, 1981) que carecen de ß-amilasa activa o que contienen solo trazas de actividad, respectivamente, aparentemente muestran crecimiento y desarrollo normal. Además, plantas de Arabidopsis transgénicas en las que los niveles de ß-amilasa se han reducido enormemente, no muestran defectos de crecimiento graves (Mita y col., 1997). Se han obstaculizado intentos para definir la función fisiológica exacta de las ß-amilasas en plantas por datos poco concluyentes concernientes a la localización subcelular. Aunque un estudio (Kakefuda y col., 1986) describió la presencia de dos ß-amilasas en cloroplastos del guisante, la mayoría de los estudios que implican especies tales como Vicia faba, cebada, trigo, soja, batata y guisante han llegado a la conclusión de que la mayor, si no toda, actividad ß-amilasa es extracloroplástica (Nakamura y col., 1991). Este punto de vista se basa en el hecho de que todos los genes ß-amilasa clonados hasta ahora codifican proteínas que carecen de secuencias peptídicas transitorias cloroplásticas amino- terminales. En cereales, se han descrito tres tipos de ß-amilasa: una forma específica del endospermo que se acumula durante la maduración de la cariópside; una forma que se sintetiza de novo en células de aleurona de arroz y maíz durante la germinación (Wang y col., 1996; 1997); y una ß-amilasa que es ubícua en órganos vegetativos. En Arabidopsis, la forma ubícua representa aproximadamente el 80% de la actividad degradativa del almidón de hojas de roseta. En común con todos los restantes genes ß-amilasa clonados hasta ahora, el gen para la ß-amilasa ubícua en Arabidopsis no codifica ninguna proteína que tenga una señal diana subcelular, por lo tanto, probablemente la enzima se localiza en el citosol. Los hallazgos, como resultado de diversos estudios realizados, en cuanto a que las actividades degradativas puede eliminarse sin efectos adversos sobre la viabilidad de la planta, junto con la localización subcelular de las enzimas degradativas del almidón fuera del plasto, son sorprendentes. La ausencia aparente de una actividad ß-amilasa localizada en plastos es especialmente sorprendentemente a la luz del hecho de que el producto final principal esperado de la actividad ß-amilasa, concretamente maltosa, se ha identificado con un producto de la degradación del almidón en... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar o disminuir la actividad de la ß-amilasa en una planta, comprendiendo el método las etapas de incorporar, de manera estable, en el genoma de una planta, un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia dirigida a plastos, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico la secuencia conocida, en la presente memoria, como SEC ID Nº: 1 y que tiene 1-294 nucleótidos y que codifica una secuencia capaz de dirigir una proteína a un plasto de una planta o secuencias que tienen una homología de al menos un 65% o más con la SEC ID Nº: 1 y que se hibridan con dicha SEC ID Nº: 1 en condiciones de medio rigurosas y que codifican una secuencia que tiene la misma capacidad de dirección y una secuencia codificante de ß-amilasa y que regenera una planta que tiene un genoma modificado. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia codificante es la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2, que es una secuencia codificante de ß-amilasa. 3. Un método para aumentar o disminuir la actividad de la ß-amilasa en una planta, comprendiendo el método las etapas de incorporar, de manera estable, en el genoma de una planta, un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico la secuencia conocida, en la presente memoria, como SEC ID Nº: 3 y que tiene 1-1953 nucleótidos y que codifica una ß-amilasa dirigida a cloroplastos o secuencias que tienen una homología de al menos un 65% o más con la SEC ID Nº: 3 y que se hibridan con dicha SEC ID Nº: 3 en condiciones de medio rigurosas y que codifican una ß-amilasa dirigida a cloroplastos y que regenera una planta que tiene un genoma modificado. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha enzima es la ß-amilasa no plastidial. 5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen quimérico comprende adicionalmente la secuencia codificante de una enzima del grupo que consiste en sacarosa sintasa, ADPG pirofosforilasa, almidón sintasa, enzima ramificadora, -amilasa, isoamilasa, ß-amilasa no plastidial, glucosidasa, almidón fosforilasa y enzima desproporcionante. 6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho gen quimérico comprende adicionalmente un promotor, siendo dicho promotor una secuencia de ácido nucleico conocida, en la presente memoria, como SEC ID Nº: 8 o que tiene al menos una homología de un 65% con la misma y que tiene sustancialmente la misma función que esta y siendo dicha secuencia de ácido nucleico sensible a estímulos, siendo el nivel de expresión de dicho producto variable en respuesta al estímulo aplicado a dicha secuencia de ácido nucleico. 7. Un método para dirigir proteínas o enzimas a un plasto de una planta, comprendiendo el método las etapas de incorporar, de manera estable, en el genoma de una planta, un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia dirigida a un plasto y una secuencia codificante de una proteína o una enzima y que regenera una planta que tiene un genoma modificado, siendo la proteína o enzima una o más en la rutas del siguiente grupo: síntesis de lípidos, fotosíntesis, metabolismo de aminoácidos, fijación de nitrógeno, fijación de carbono o síntesis de polímeros de hidratos de carbono o que es capaz de conferir una característica a la planta, siendo la secuencia de ácido nucleico la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o teniendo la secuencias una homología de al menos un 65% o más con la SEC ID Nº: 1 y que se hibridan con dicha SEC ID Nº: 1 en condiciones de medio rigurosas y que codifican una secuencia que tiene la misma capacidad de dirección. . 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicha característica se selecciona de uno o más de los siguientes grupos: resistencia a herbicidas y resistencia a plagas. 9. Una secuencia de ácido nucleico conocida, en la presente memoria, como SEC ID Nº: 1 y que tiene 1-294 nucleótidos y que codifica una secuencia capaz de dirigir una proteína a un plasto de una planta o secuencias que tienen una homología de al menos un 65% o más con la SEC ID Nº: 1 y que se hibrida con dicha SEC ID Nº: 1 en condiciones de medio rigurosas y que codifica una secuencia que tiene la misma capacidad de dirección. 10. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha secuencia codifica 85 restos de aminoácidos. 11. Una secuencia de ácido nucleico conocida, en la presente memoria, como SEC ID Nº: 3 y que tiene 1-1953 nucleótidos y que codifica una ß-amilasa dirigida a cloroplastos o secuencias que tienen una homología de al menos un 65% o más con la secuencia descrita en la SEC ID Nº: 3 y que se hibridan con dicha SEC ID Nº: 3 en condiciones de medio rigurosas y que codifican una ß-amilasa dirigida a cloroplastos. 12. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en la que dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ARNm, ADNc o ADN genómico.   13. Un método de modificación en una planta transgénica, cuya planta ya presenta un aumento o disminución de una actividad enzimática en la ruta biosintética del almidón como resultado de transformación genética, una enzima adicional para regular positiva o negativamente dicha enzima adicional y por lo tanto aumentar o disminuir la cantidad de almidón producido por la planta retransformada, siendo dicha enzima adiciona una ß-amilasa dirigida a plastos que se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 1 o secuencias que tienen una homología de al menos un 65% con la SEC ID Nº: 1 y que se hibridan con dicha SEC ID Nº: 1 en condiciones de medio rigurosas y que codifican una secuencia que tiene la misma capacidad de dirección. 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 2 codifica dicha ß-amilasa dirigida a plastos. 15. un método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha primera planta transformada es una planta de patata transgénica transformada con el gen de adenosina difosfoglucosa fosforilasa (ADPG-PPAsa). 16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 7, en el que dicho gen quimérico comprende adicionalmente un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (completo o truncado), el promotor de rubisco, el promotor de plastocianina del guisante, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de unión a clorofila a/b, el promotor de glutenina de alto peso molecular, el promotor de ,ß-gliadina, el promotor de hordeína y el promotor de patatina. 17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 7, en el que dicha secuencia codificante de dicha enzima en dicho gen quimérico proporciona regulación positiva o negativa de la actividad de dicha enzima. 18. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9. 19. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia dirigida a plastos de acuerdo con la reivindicación 9 y un ácido nucleico que codifica la secuencia de una enzima en la ruta degradativa del almidón, codificándose la enzima por la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº: 2. 20. Células vegetales que comprenden la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 9, 11 ó 12. 21. Semilla de la planta transformada que contiene una o más de la secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 9 o de la reivindicación 11. 22. Plantas que comprenden células vegetales de acuerdo con la reivindicación 20. 23. Plantas de acuerdo con la reivindicación 22, en la que dichas plantas son una o más del grupo que consiste en patata, trigo, maíz, cebada, tomate, arroz, guisante, soja, cacahuete, yuca, ñame, banana y tabaco. 26   27   28   29     31   32   33   34