PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN QUE USA UN GEN DE UNA ACETOLACTATO-SINTASA MUTANTE.

Procedimiento de transformación que usa un gen de una acetolactato-sintasa mutante Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación y a un procedimiento para el cultivo de una planta que usa una acetolactato-sintasa mutante en la que se introduce una mutación en una posición predeterminada de una acetolactato-sintasa natural. Antecedentes [0002] La acetolactato-sintasa (denominada en adelante ALS) es una enzima limitante de la velocidad en la ruta biosintética de los aminoácidos de cadena ramificada, como leucina, valina e isoleucina y es conocida como una enzima esencial para el crecimiento de las plantas. También se sabe que la ALS está presente en una amplia diversidad de plantas superiores. Además, la ALS se ha descubierto en diversos microorganismos, como levaduras (Saccharomyces cerevisiae), Escherichia coli y Salmonella typhimurium. [0003] Se conocen tres tipos de isoenzimas de la ALS presentes en Escherichia coli y Salmonella 20 typhimurium. Cada una de estas isoenzimas es un heterooligómero que consta de subunidades catalíticas de alto peso molecular que rigen la actividad catalítica de la enzima y subunidades reguladoras de bajo peso molecular que funcionan como inhibidores de retroalimentación a través de la unión de aminoácidos de cadena ramificada (Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998 [documento no correspondiente a patente 1]). Las subunidades catalíticas se localizan en los operones iIvIH, iIvGM y e iIvBN, respectivamente. Además, la ALS en 25 levaduras es una enzima única que consta de una subunidad catalítica y una subunidad reguladora, como en el caso der las bacterias (Pang y col., Biochemistry 38, 5222-5231, 1999 [documento no correspondiente a patente 2]). La subunidad catalítica de la proteína se localiza en el locus ILV2. [0004] En las plantas, se sabe que la ALS consta de subunidades catalíticas y subunidades reguladoras, 30 como en el caso de los microorganismos anteriores (Hershey y col., Plant Molecular Biology 40, 795-806, 1999 [documento no correspondiente a patente 3]). Por ejemplo, las subunidades catalíticas de la ALS en tabaco (dicotiledónea) están codificadas por dos loci génicos, SuRA y SuRB (Lee y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988 [documento no correspondiente a patente 4]), y las de maíz están codificadas por dos loci génicos, als1 y als2 (Burr y col., Trends in Genetics 7, 55-61, 1991 [documento no correspondiente a patente 5]; Lawrence y col., Plant Mol. 35 Biol. 18, 1185-1187, 1992 [documento no correspondiente a patente 6]). Las secuencias nucleotídicas de los genes que codifican las subunidades catalíticas han sido determinadas en su totalidad para plantas dicotiledóneas, como tabaco, Arabidopsis, colza, algodón, Xanthium, Amaranthus y Kochia (véanse Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998 [documento no correspondiente a patente 1] y la publicación internacional WO97/08327 [documento de patente 1]). Sin embargo, el maíz y el arroz son las únicas plantas monocotiledóneas para las que se 40 han determinado las secuencias nucleotídicas en su totalidad.   [0005] Mientras tanto, se sabe que herbicidas como los herbicidas de sulfonilurea, los herbicidas de imidazolinona, los herbicidas de triazolopirimidina y los herbicidas de carboxipirimidinilo (denominados de ahora en adelante, herbicidas de PC) suprimen el crecimiento de las plantas por inhibición de la ALS (Ray, Plant Physiol. 75, 827-831, 1984 [documento no correspondiente a patente 7]; Shaner y col., Plant Physiol. 76, 545-546, 1984 [documento no correspondiente a patente 8]; Subramanian y col., Plant Physiol. 96, 310-313, 1991 [documento no correspondiente a patente 9]; Shimizu y col., J. Pestic. Sci. 19, 59-67, 1994 [documento no correspondiente a patente 10]. 50 [0006] Se sabe que plantas con una o dos sustituciones de nucleótidos en un gen que codifica la ALS, que inducen una o dos sustituciones de aminoácidos en una región conservada entre diferentes especies, presentan resistencia a estos herbicidas. Algunos ejemplos de un gen semejante incluyen un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de sulfonilurea (véanse Kathleen y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988 [documento no correspondiente a patente 11]; Mourad y col., Planta 188, 491-497, 1992 [documento no 55 correspondiente a patente 12]; Guttieri y col., Weed Sci. 43, 175-178, 1995 [documento no correspondiente a patente 13]; Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385, 1995 [documento no correspondiente a patente 14], y la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de imidazolinona (véanse Mourad y col., Panta 188, 491-497, 1992 [documento no correspondiente a patente 12]; Lee y col., FEBS Lett. 452, 341-345, 1999 [documento no 60 correspondiente a patente 15], y la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3]); un gen que codifica una ALS con una fuerte resistencia a los herbicidas de PC (véanse los documentos WO02/44385A1 [documento de patente 4] y WO03/083118A1 [documento de patente 5]), y un gen que codifica una ALS con resistencia a herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona y PC (véanse Kathleen y col., EMBO J. 7, 1241- 1248, 1988 [documento no correspondiente a patente 11]; Bernasconi y col., J. Biol. Chem. 270, 17381-17385 65 [documento no correspondiente a patente 14]; Hattori y col., Mol. Gen. Genet. 246, 419-425, 1995 [documento no 2   correspondiente a patente 16]; Alison y col., Plant Physiol. 111, 1353, 1996 [documento no correspondiente a patente 17]; Rajasekarau y col., Plant Sci. 119, 115-124, 1996 [documento no correspondiente a patente 18]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 4-311392 A (1992) [documento de patente 6]; Bernasconi y col., patente de los EE. UU. 5633437, 1997 [documento de patente 7] y los documentos WO02/44385A1 [documento de patente 4] y WO03/083118A1 [documento de patente 5]). [0007] Los documentos siguientes discuten también la mutación de la acetolactato-sintasa con el fin de conferir resistencia a herbicidas: Shimizu y col. (2005) Environmental Fate and Safety Management of Agrochemicals, vol. 899, páginas 255-271; Mazur y Falco (1989) Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology, vol. 40, páginas 441-470, y Okuzaki y col. (2004) Plant Cell Reports, vol. 22, páginas 509-512. [0008] Se ha intentado la producción de una planta que muestre resistencia tanto a los herbicidas de sulfonilurea y como de imidazolinona mediante el cruzamiento de una planta con una ALS que muestra resistencia específicamente a los herbicidas de sulfonilurea con una planta con una ALS que muestra resistencia específicamente a los herbicidas de imidazolinona (Mourad y col., Mol. Gen. Genet. 243, 178-184, 1994 [documento no correspondiente a patente 19]). Además se ha intentado la alteración artificial de un gen que codifica una ALS para obtener un gen de resistencia a herbicidas (Véanse Ott y col., J. Mol. Biol. 263, 359-368, 1996 [documento no correspondiente a patente 20]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 63-71184 A (1988) [documento de patente 2]; la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3], y la publicación de patente japonesa (Kohyo) n° 11-504213 A (1999) [documento de patente 8]). De este modo, se ha puesto de manifiesto que la deleción de un solo aminoácido hace que la ALS muestre resistencia a los herbicidas tanto de sulfonilurea como de imidazolinona (véase la publicación de patente japonesa (Kokai) n° 5-227964 A (1993) [documento de patente 3]). [0009] Tal como se describe anteriormente, las ALS con resistencia a herbicidas y los genes codificantes de ALS se han estudiado intensamente. Sin embargo, hasta ahora no se han descrito casos relativos a un gen de una ALS mutante que presente resistencia específicamente a los herbicidas de PC solamente con el uso de la resistencia a herbicidas de PC como indicador. En caso de obtener un gen de una ALS mutante con resistencia específica a un herbicida específico, dicho gen de ALS mutante puede usarse para diversas aplicaciones. Hasta el momento no se han descrito casos relativos a un gen de una ALS mutante semejante que sea útil en cuanto a su especificidad para herbicidas de PC. Documento no correspondiente a patente 1: Chipman y col., Biochim. Biophys. Acta 1385, 401-419, 1998 Documento no correspondiente a patente 2: Pang y col., Biochemistry 38, 5222-5231, 1999 Documento no correspondiente a patente 3: Hershey y col., Plant Molecular Biology 40, 795-806, 1999 Documento no correspondiente a patente 4: Lee y col., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988 Documento no correspondiente a patente 5: Burr y col.,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de transformación que comprende las etapas de: 5 transformación de una célula hospedadora con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;   cultivo de la célula transformada obtenida en la primera etapa en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección. 2. El procedimiento de transformación según la reivindicación 1, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente: (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO:3 a 14. 3. El procedimiento de transformación según las reivindicaciones 1 ó 2, en que la célula hospedadora es una célula vegetal. 4. El procedimiento de transformación según la reivindicación 3, en el que dicha célula hospedadora es una célula de arroz, maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, raigrás italiano, tabaco o Arabidopsis thaliana. 5. Un procedimiento para el cultivo de una planta, que comprende las etapas de: transformación de una célula vegetal con un vector de recombinación que contiene un gen de interés y un gen que codifica una acetolactato-sintasa vegetal mutante con una mutación de glicina a alanina en un resto de glicina correspondiente a la posición 95 de SEQ ID NO:2; cultivo de la planta transformada obtenida en la etapa anterior en presencia de un herbicida de carboxipirimidinilo, en que el gen que codifica la acetolactato-sintasa mutante se usa como marcador de selección. 6. El procedimiento para el cultivo de una planta según la reivindicación 5, en que el gen que codifica la acetolactatosintasa mutante es un gen que codifica la proteína (a) o (b) siguiente: (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO:3 a 14. 7. El procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6, en que dicha planta es arroz, maíz, trigo, cebada, soja, algodón, colza, remolacha, raigrás italiano, tabaco o Arabidopsis thaliana. 48   49     51   52   53   54