Un método para detectar la presencia de E. coli patógeno en una muestra,

comprendiendo el método:

(a) realizar amplificación por PCR de la muestra utilizando un par de iniciadores seleccionado del grupo constituido por:

(i) SEQ ID NOs: 2 y 3,

(ii) SEQ ID NOs: 5 y 6,

(iii) SEQ ID NOs: 8 y 9,

(iv) SEQ ID NOs: 10 y 11,

(v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y

(vi) SEQ ID NOs: 16 y 17,

para producir un resultado de amplificación por PCR; y

(b) examinar el resultado de la amplificación por PCR del paso (a) para detectar un producto de amplificación del par de iniciadores, en cuyo caso una detección positiva del producto de amplificación del par de iniciadores indica la presencia de E. coli patógeno en la muestra.

Secuencias de DNA para la detección de y diferenciación entre cepas de E. coli patógenas.

Campo de la invención El campo de la invención se refiere a un método rápido para detección de y diferenciación entre bacterias Escherichia coli basado en la presencia de secuencias de ácido nucleico, en particular, a un método de detección basado en PCR, y a moléculas de oligonucleótidos y reactivos y kits útiles para el mismo.

Antecedentes de la invención

Escherichia coli (E. coli) es una bacteria gram-negativa con forma de bastoncillo. Aunque la mayoría de las cepas de E. coli son benignas y se encuentran como flora intestinal normal de los humanos y otros animales, algunas cepas son patógenas y pueden conducir a enfermedades a veces fatales. Diferentes cepas de E. coli patógeno difieren en su epidemiología, curso clínico y potencial para causar brotes de enfermedad. El pase de la enfermedad es generalmente a través de la vía fecal/oral.

La patogenicidad se ha ligado a varios serotipos, que se definen por los antígenos O y H. Los diferentes serotipos patógenos se han asociado con diferentes cursos clínicos de la enfermedad y llevan asociados con ellos diferentes niveles de preocupación desde el punto de vista de la salud pública. Varios brotes de enfermedad han sido localizados en fuentes de E. coli patógeno transportadas por los alimentos y el agua.

Un serotipo en particular es el serotipo E. coli O157:H7, ha sido asociado con varios brotes transportados por alimentos y agua y está regulado como adulterante en la carne picada de vacuno por la USDA con un estándar de tolerancia cero.

Dado que E. coli es ubicuo, y la mayoría de los serotipos son no patógenos, la posibilidad de detectar serotipos patógenos, y diferenciar entre serotipos patógenos con diferentes implicaciones clínicas y de salud pública es útil.

Por consiguiente, es deseable disponer de un test para la detección rápida de E. coli patógenos y diferenciar aquéllos que son cause de preocupación desde el punto de vista de la salud pública y la regulación.

Sumario de la invención

La presente invención incluye:

Un método para detectar la presencia de E. coli patógeno en una muestra, que comprende (a) realizar amplificación por PCR de la muestra utilizando un par de iniciadores seleccionados del grupo constituido por (i) SEQ ID NOs: 2 y 3, (ii) SEQ ID NOs: 5 y 6, (iii) SEQ ID NOs: 8 y 9, (iv) SEQ ID NOs: 10 y 11, (v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y (vi) SEQ ID NOs: 16 y 17, para producir un resultado de amplificación por PCR; y (b) examinar el resultado de la amplificación por PCR del paso (a) para detectar un producto de amplificación del par de iniciadores, en cuyo caso una detección positiva del producto de amplificación del par de iniciadores indica la presencia de E. coli patógeno en la muestra. Preferiblemente, el par de iniciadores se selecciona del grupo constituido por (a) (ii) , (a) (iii) y (a) (iv) .

Un método para detectar la presencia de E. coli patógeno en una muestra, comprendiendo el método: (a) realizar amplificación por PCR de la muestra utilizando dos pares de iniciadores diferentes seleccionados del grupo constituido por (i) SEQ ID NOs: 2 y 3, (ii) SEQ ID NOs: 5 y 6, (iii) SEQ ID NOs: 8 y 9, (iv) SEQ ID NOs: 10 y 11, (v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y (vi) SEQ ID NOs: 16 y 17, para producir un resultado de amplificación por PCR; y (b) examinar el resultado de la amplificación por PCR del paso (a) para detectar productos de amplificación de los dos pares de iniciadores diferentes, en cuyo caso una detección positiva de los productos de amplificación de los dos pares de iniciadores diferentes, indica la presencia de E. coli patógeno en la muestra. Los dos pares de iniciadores diferentes comprenden preferiblemente (a) (ii) y (a) (iii) , y aún más preferiblemente (a) (ii) y (a) (iv) .

Cualquiera de los métodos anteriores, en donde en el paso (b) se utiliza un análisis de la curva de fusión para detectar el producto de amplificación.

Cualquiera de los métodos anteriores, que comprende adicionalmente un paso de preparación de la muestra para amplificación por PCR antes de dicho paso (a) . Preferiblemente, el paso de preparación comprende al menos uno de los procesos siguientes: (1) enriquecimiento bacteriano, (2) separación de las células bacterianas de la muestra, (3) lisis celular, y (4) extracción del DNA total.

Cualquiera de los métodos anteriores, en donde la muestra comprende una muestra de alimentos, una muestra de agua, o una matriz de alimentos enriquecida selectivamente.

Un polinucleótido aislado para detección de E. coli patógeno que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17.

Un kit para detección de E. coli patógeno, que comprende (a) al menos un par de iniciadores seleccionados del grupo constituido por (i) SEQ ID NOs:2 y 3, (ii) SEQ 1D NOs:5 y 6, (iii) SEQ ID NOs:8 y 9, (iv) SEQ ID NOs:10 y 11, (v) SEQ ID NOs:13 y 14, y (vi) SEQ ID NOs:16 y 17; y (b) DNA-polimerasa termoestable. El kit comprende preferiblemente a la vez (a) (ii) y (a) (iii) , y aún más preferiblemente, a la vez (a) (ii) y (a) (iv) .

Una composición de replicación para uso en la realización de una PCR, que comprende al menos un par de iniciadores seleccionados del grupo constituido por (i) SEQ ID NOs:2 y 3, (ií) SEQ ID NOs:5 y 6, (iii) SEQ ID NOs:8 y 9, (iv) SEQ ID NOs:10 y 11, (v) SEQ ID NOs:13 y 14, y (vi) SEQ ID NOs:16 y 17; y (b) DNA-polimerasa termoestable. La composición de replicación comprende preferiblemente a la vez (a) (ii) y (a) (iii) , y aún más preferiblemente, a la vez (a) (ii) y (a) (iv) .

Una tableta que comprende cualquiera de las composiciones de replicación anteriores, y un kit para detección de E. coli patógeno en una muestra, que comprende la tableta.

Sumario de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos de E. coli patógeno cuya detección demuestra específicamente la presencia de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM, O55:H7, O26:H11, o 0145:HNM. SEQ ID NO:1 está limitada por, contiene, y está amplificada por los iniciadores SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador 5' a una región del genoma de E. coli patógeno que amplificará específicamente DNA de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM, O55:H7, O26:H11, o 0145:HNM en una reacción en cadena de polimerasa con DNA bacteriano y SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador 3' a una región del genoma de E. coli patógeno que amplificará específicamente DNA de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM, O55:H7, O26:H11, o 0145:HNM en una reacción en cadena de polimerasa con DNA bacteriano y SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos de E. coli patógeno cuya detección muestra específicamente la presencia de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM, O55:H7, O26:H11, O26:HNM, 0145:HNM, o 0111:HNM. SEQ ID NO:4 está limitada por, contiene, y está amplificada por el uso de los iniciadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador 5' a una región del genoma de E. coli patógeno que amplificará específicamente DNA de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM, O55:H7, O26:H11, O26:HNM, 0145:HNM, o 0111:HNM en una reacción en cadena de polimerasa con DNA bacteriano y SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador 3' a una región del genoma de E. coli patógeno que amplificará específicamente DNA de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:11NM. O55:H7, O26:H11, O26:HNM, 0145:HNM, o 0111:HNM en una reacción en cadena de polimerasa con DNA bacteriano y SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos de E. coli patógeno cuya detección indica específicamente la presencia de E. coli patógeno de serotipos O157:H7, O157:HNM u O55:H7. SEQ ID NO:7 está limitada por, contiene, y está amplificada por el uso de iniciadores SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 5 está amplificada también por el uso de iniciadores representados por SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, que son modificaciones de SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador 5' a una región del genoma de E. coli... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de E. coli patógeno en una muestra, comprendiendo el método:

(a) realizar amplificación por PCR de la muestra utilizando un par de iniciadores seleccionado del grupo constituido por:

(i) SEQ ID NOs: 2 y 3,

(ii) SEQ ID NOs: 5 y 6,

(iii) SEQ ID NOs: 8 y 9,

(iv) SEQ ID NOs: 10 y 11,

(v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y

(vi) SEQ ID NOs: 16 y 17, para producir un resultado de amplificación por PCR; y

(b) examinar el resultado de la amplificación por PCR del paso (a) para detectar un producto de amplificación del par de iniciadores, en cuyo caso una detección positiva del producto de amplificación del par de iniciadores indica la presencia de E. coli patógeno en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el par de iniciadores se selecciona del grupo constituido por (a) (ii) , (a) (iii) , y (a) (iv) .

3. El método de la reivindicación 1, en donde el par de iniciadores comprende (a) (ii) .

4. El método de la reivindicación 1, en donde el par de iniciadores comprende (a) (iii) .

5. El método de la reivindicación 1, en donde el par de iniciadores comprende (a) (iv) .

6. Un método para detectar la presencia de E. coli patógeno en una muestra, comprendiendo el método:

(a) realizar la amplificación por PCR de la muestra utilizando dos pares de iniciadores diferentes seleccionados del grupo constituido por:

(i) SEQ ID NOs: 2 y 3,

(ii) SEQ ID NOs: 5 y 6,

(iii) SEQ ID NOs: 8 y 9,

(iv) SEQ ID NOs: 10 y 11,

(v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y

(vi) SEQ ID NOs: 16 y 17, para producir un resultado de amplificación por PCR; y

(b) examinar el resultado de la amplificación por PCR del paso (a) para detectar productos de amplificación de los dos pares de iniciadores, en cuyo caso una detección positiva de los productos de amplificación de los dos pares de iniciadores diferentes indica la presencia de E. coli patógeno en la muestra.

7. El método de la reivindicación 6, en donde los dos pares de iniciadores comprenden (a) (ii) y (a) (iv) .

8. El método de la reivindicación 6, en donde los dos pares de iniciadores comprende (a) (ii) y (a) (iii) .

9. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde en el paso (b) se utiliza un análisis de curva de fusión para detectar el producto de amplificación.

10. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende adicionalmente un paso de preparación de la muestra para amplificación por PCR antes de dicho paso (a) .

11. El método de la reivindicación 10, en donde dicho paso de preparación comprende al menos uno de los procesos siguientes: (1) enriquecimiento en bacterias, (2) separación de las células bacterianas de la muestra, (3) lisis celular, y (4) extracción del DNA total.

12. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la muestra comprende una muestra de alimentos o una muestra de agua.

13. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la muestra comprende una matriz de alimentos enriquecida selectivamente.

14. Un polinucleótido aislado para detección de E. coli patógeno que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ 1D NO:14, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17.

15. Un kit para detección de E. coli patógeno, que comprende:

(a) al menos un par de iniciadores seleccionados del grupo constituido por:

(i) SEQ ID NOs: 2 y3,

(ii) SEQ ID NOs: 5 y 6,

(iii) SEQ ID NOs: 8 y 9,

(iv) SEQ ID NOs: 10 y 11,

(v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y

(vi) SEQ ID NOs: 16 y 17; y

(b) DNA-polimerasa termoestable.

16. El kit de la reivindicación 15, en donde el componente (a) comprende a la vez (a) (ii) y (a) (iv) .

17. El kit de la reivindicación 15, en donde el componente (a) comprende a la vez (a) (ii) y (a) (iii) .

18. Una composición de replicación para uso en la realización de una PCR, que comprende:

(a) al menos un par de iniciadores seleccionados del grupo constituido por:

(i) SEQ ID NOs: 2 y3,

(ii) SEQ ID NOs: 5 y 6,

(iii) SEQ ID NOs: 8 y 9,

(iv) SEQ ID NOs: 10 y 11,

(v) SEQ ID NOs: 13 y 14, y

(vi) SEQ ID NOs: 16 y 17, y

(b) DNA-polimerasa termoestable.

19. La composición de replicación de la reivindicación 18, en donde el componente (a) comprende a la vez (a) (ii) y (a) (iv) .

20. La composición de replicación de la reivindicación 18, en donde el componente (a) comprende a la vez (a) (ii) y (a) (iii) .

21. Una tableta que comprende la composición de replicación de la reivindicación 18, 19, ó 20.

22. Un kit para detección de E. coli patógeno en una muestra, que comprende la tableta de la reivindicación 21.

FIG. 1

Mecanismo del análisis de la curva de fusión Transformación de los datos

Datos Brutos Datos procesados

Las transformaciones de los datos implican lo siguiente:

1. Interpolación de los datos para obtener puntos de datos espaciados uniformemente

2. Toma del logaritmo de la fluorescencia (F)

3. Alisar log F

4. Calcular -d (log F) /dT

5. Reducción de los datos a 11-13 puntos de datos espaciados con un grado de separación dependiendo del organismo diana

FIG. 2

CURVA DE FUSIÓN DE SEQ ID NO: 1 AMPLIFICADA POR PS1

SEQ ID NO:1 amplificada por PS1

FIG. 3

CURVA DE FUSIÓN DE SEQ ID NO: 4 AMPLIFICADA POR PS2

SEQ ID NO: 4 amplificada por PS2

FIG. 4

CURVA DE FUSIÓN DE SEQ ID NO: 7 AMPLIFICADA POR PS3

SEQ ID NO: 7 amplificada por PS3

FIG. 5

CURVA DE FUSIÓN PARA PCR MULTI-DIANA, CONTROL POSITIVO INTERNO, SEQ ID NO: 4 AMPLIFICADA CON PS2 Y SEQ ID NO: 7 AMPLIFICADA CON PS4