Una rosa caracterizada por comprender una malvidina, una flavona y delfinidina añadidas mediante un métodode modificación genética,

por expresión de un gen de antocianina metiltransferasa, un gen de flavona sintasa y elgen de la flavonoide 3',5'-hidroxilasa del pensamiento (Viola x wittrockiana).

Rosa que contiene flavona y malvidina, y método para su producción.

Campo de la invención La invención se refiere a una rosa obtenida artificialmente que contiene una flavona y una malvidina añadidas mediante un método de modificación genética, por expresión de un gen de antocianina metiltransferasa, un gen de flavona sintasa y el gen de la flavonoide 3’, 5’.hidroxilasa del pensamiento (Viola x wittrockiana) . La invención se refiere, además, a un método para modificar el color de los pétalos de la rosa mediante un efecto de pigmentación conjunta (copigmentación) producido por la adición de una flavona y una malvidina mediante ingeniería genética, por expresión de un gen de antocianina metiltransferasa, un gen de flavona sintasa y el gen de la flavonoide 3’.5’hidroxilasa del pensamiento (Viola x Wittrockiana) , y en particular, a un método para alterar el color de los pétalos hacia el azul.

Antecedentes de la invención

Las flores son órganos reproductivos de las plantas que se requieren para la producción de semillas para las generaciones subsiguientes. La formación de las semillas requiere la adherencia del polen a los pistilos, y la fertilización. El polen es transportado habitualmente por insectos tales como abejas y mariposas, pájaros tales como los colibríes, y rara vez por los murciélagos. El papel de los pétalos de las flores es el de atraer a estos organismos que transportan el polen, y las plantas han desarrollado para esta finalidad modificaciones del color floral, de la forma, y del tipo de coloración.

Dado que el color de las flores es, asimismo, el rasgo más importante de las flores ornamentales, flores de diversos colores han sido obtenidas tradicionalmente por cruzamiento de especies. Sin embargo, es raro que una variedad de plantas tenga colores florales diferentes y, por ejemplo, el cruzamiento de especies no ha producido variedades de colores púrpura a azul de rosas (Rosa hybrida) , claveles (Dianthus car y ophyllus) . crisantemos (Chr y santhemum morifolium) , o lirios (Lilium spp) , ni variedades de color rojo brillante del iris de jardín Japonés (Iris ebsata Thumb.) , ni de la genciana (Gentiana triflora) .

Los colores de las flores que van desde amarillo pálido hasta rojo o azul, son debidos, generalmente, a la presencia de flavonoides y antocianinas (glucósidos coloreados que pertenecen a la clase de los flavonoides) . Los flavonoides son metabolitos secundarios comunes de las plantas, que tienen una cadena principal básica de C6C3C6, y son sintetizados a partir de fenilalanina y malonil-CoA, como se indica seguidamente. Están clasificados como flavonas, flavonoles, etc., según los estados de oxidación de los anillos de C.

Los flavonoides absorben radiaciones ultravioleta y separan radicales, y se cree, por consiguiente, que su función original es la de proteger los cuerpos de las plantes de diversas formas de tensión. También han recibido atención en los últimos años como componentes saludables (véase la publicación de Harborne y Williams en Phytochemistr y 55, 481-504, 2000) .

Se conocen varios cientos de especies moleculares de antocianinas coloreadas, y de las antocianinas cromóforas, las más comunes son las correspondientes a los 6 tipos siguientes: (1) pelargonidina, abundante en flores de color anaranjado a rojo, (2) cianidina y peonidina, abundantes en flores de color rojo a carmesí, y (3) delfinidina, petunidina y malvidina, abundantes en flores de color violeta a azul La estructura de las antocianinas tiene un efecto de la mayor importancia sobre el color. Un número aumentado de grupos hidroxilo sobre el anillo B de la antocianina da por resultado un mayor grado de azul. Las antocianinas del tipo de la delfinidina son más azules que las antocianinas del tipo de la pelargonidina y que las antocianinas del tipo de la cianidina. La síntesis biológica de los flavonoides, con inclusión de las antocianinas, está altamente 15 conservada a través de las especies de plantas. Los flavonoides son biosintetizados en el citosol y después de la adición de azúcares y de grupos acilo, son transportados a las vacuolas y acumulados (véanse las publicaciones de Tanak et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 80, 1-24, 2005, y Tanaka and Brugliera, Ainsworth, ed. (2006) , Flowering and its manipulation, páginas 201-239 , Blackwell Publishing Ltd.) .

Los genes estructurales que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis, han sido todos clonados. La creación de plantas recombinantes permite, por consiguiente, modificar las estructuras y cantidades de flavonoides que se acumulan en las flores mediante expresión artificial de sus genes, alterando con ello el color de las flores (Tanaka et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 80. 1-24 (2005) , Tanaka y Brugliera, Ainsworth (2006) , Flowering and its manipulation, páginas 201-239, Blackwell Publishing Ltd, ) . Por ejemplo, en los claveles o las rosas que no pueden producir delfinidina en los pétalos, ha sido expresado el gen de la flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (abreviado en lo sucesivo como “F3’5’H”) , necesario para la síntesis de delfinidina, produciendo delfinidina y creando una flor artificial de color azul (véase la publicación de Tanaka en Phytochemistr y Reviews, 5, 283-291 (2006) .

Tales métodos para modificar artificialmente el metabolismo de las plantes son denominados frecuentemente “ingeniería metabólica”. Con objeto de modificar el metabolismo para acumular una sustancia de interés, es posible la expresión del gen que codifica la enzima que produce la sustancia de interés en una planta recombinante, pero en muchos casos la competición con las enzimas endógenas de la misma planta da por resultado una acumulación pequeña o absolutamente ninguna acumulación de la sustancia de interés, y, por tanto, no se obtiene una consecuencia útil desde el punto de vista industrial.

Por ejemplo, las petunias (Petunia hybrida) no acumulan pelargonidina debido a la especificidad de la dihidroflavonol reductasa (abreviada en lo sucesivo como “DFR”) , y, por consiguiente, no existen variedades naturales con flores de color anaranjado.

Si bien se ha informado de petunias de color anaranjado que acumulan pelargonidina por transferencia del gen de la DFR procedente de rosas o de plantas semejantes, la acumulación de pelargonidina requiere el uso de variedades de petunias que carezcan de los genes que codifican la flavonoide 3’-hidroxilasa (abreviado en lo sucesivo como “F3’H”) , F3’5’H y la flavonol sintasa (abreviado en lo sucesivo como “FLS”) , que compiten con DFR, debido a que no se observa cambio en el fenotipo cuando el gen DFR de la rosa es transferido a petunias que no carecen de estos genes) (véase la publicación de Tanaka y Brugliera, en Ainsworth (2006) , Flowering and its manipulation, páginas 201-239, Blackwell Publishing Ltd´) . Por consiguiente, no puede predecirse si un compuesto de interés se acumulará poniendo de manifiesto el fenotipo deseado, simplemente por transferencia de un gen de interés.

Además, la ingeniería metabólica produce frecuentemente resultados impredecibles. Por ejemplo, cuando la expresión del gen de flavona sintasa fue inhibido en plantas torenia (Torenia hybrida) , el contenido de flavonas estaba reducido y se observó una acumulación de flavanonas. Podría esperarse que la acumulación de flavanonas diera como resultado un contenido aumentado de antocianinas, pero en realidad el contenido de antocianinas había disminuido (Ueyama et al., Plant Science, 163, 253-263, (2002) ) . Por tanto, es difícil predecir cambios de metabolitos y han sido necesarias modificaciones persistentes para obtener los fenotipos deseados.

Las antocianinas con mayores números de grupos acilo aromáticos, aparecen también más azules debido a un efecto intramolecular de copigmentos. Las antocianinas con dos o más grupos acilo aromáticos se conocen como antocianinas poliaciladas y ponen de manifiesto un color azul estable (véase la publicación de Harborne y Williams, en Phytochemistr y , 55, 481-504 (2000) ) .

El color de una flor cambia, no solamente por la estructura de los propios pigmentos de antocianinas como los pigmentos esenciales, sino también debido a los flavonoides presentes conjuntamente (conocidos también como copigmentos) , a los iones metálicos y al pH de las vacuolas. Por ejemplo, las flavonas o los flavonoles son copigmentos típicos que forman pilas tipo “sandwich” con las antocianinas y hacen que las antocianinas... [Seguir leyendo]

1:-Una rosa caracterizada por comprender una malvidina, una flavona y delfinidina añadidas mediante un método de modificación genética, por expresión de un gen de antocianina metiltransferasa, un gen de flavona sintasa y el gen de la flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa del pensamiento (Viola x wittrockiana) .

2. Una rosa según la reivindicación 1, en la que el gen de flavona sintasa es un gen de flavona sintasa derivado desde la familia de las escrofulariáceas.

3. Una rosa según la reivindicación 2, en la que el gen de flavona sintasa derivado desde la familia de las escrofulariáceas es un gen de flavona sintasa derivado desde la planta boca de dragón de la familia de las escrofulariáceas (Scrophulariaceae, Antirrhinum majus) .

4. Una rosa según la reivindicación 2, en la que el gen de flavona sintasa derivado desde la familia de las escrofulariáceas es un gen de flavona sintasa derivado desde la planta torenia de la familia de las escrofulariáceas (Scrophulariaceae, Torenia hybrida)

5. Una rosa según la reivindicación 3, en la que el gen de flavona sintasa derivado desde la planta boca de dragón de la familia de las escrofulariáceas es un gen que codifica:

(1) flavona sintasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO:2,

(2) flavona sintasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 2, modificada por la adición o supresión de uno o varios aminoácidos y/o la sustitución de uno o varios aminoácidos por otros aminoácidos

(3) flavona sintasa que posee una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de 90% al menos, con la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 2, ó

(4) flavona sintasa codificada por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en condiciones altamente restrictivas.

6. Una rosa según la reivindicación 4, en la que el gen de flavona sintasa derivado desde la planta torenia de la familia de las escrofulariáceas es un gen que codifica

(1) flavona sintasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 4,

(2) flavona sintasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 4, modificada por la adición o supresión de uno o varios aminoácidos y/o la sustitución de uno o varios aminoácidos por otros aminoácidos,

(3) flavona sintasa que posee una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de 90% al menos, con la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 4, ó

(4) flavona sintasa codificada por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, en condiciones altamente restrictivas.

7. Una rosa según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, en la que el gen de la flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa es un gen que codifica:

(1) flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 8,

(2) flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 8, modificada por la adición o supresión de uno o varios aminoácidos y/o la sustitución de uno o varios aminoácidos por otros aminoácidos,

(3) flavonoide 3’.5’-hidroxilasa que posee una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de 90% al menos, con la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 8, ó

(4) flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa codificada por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que posee la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, en condiciones altamente restrictivas.

(1) metiltransferasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 10,

(2) metiltransferasa que posee la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 10, modificada por la adición o supresión de uno o varios aminoácidos y/o la sustitución de uno o varios aminoácidos por otros aminoácidos,

8. Una rosa según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en la que el gen de antocianina metiltransferasa es un gen que codifica:

(3) metiltransferasa que posee una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de 90% al 5 menos, con la secuencia de aminoácidos registrada como SEQ ID NO: 10, ó

(4) metiltransferasa codificada por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en condiciones altamente restrictivas.

9. Una rosa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el color floral está cambiado con respecto al del huésped.

10. Una rosa según la reivindicación 9, en la que el cambio del color floral es un cambio hacia el azul.

11. Una rosa según la reivindicación 9 ó 10, en la que el cambio del color floral es un cambio tal que el ángulo de color (θ) , según el diagrama de cromaticidad del sistema de color L*a*b, se aproxima a 270º que es el eje del azul.

12. Una rosa según la reivindicación 9, en la que el cambio del color floral es un cambio tal que el valor mínimo del espectro de reflexión del pétalo se desplaza hacia el extremo de longitudes de onda más largas.

13. Una parte de la rosa, descendiente, tejido, cuerpo vegetativo o célula, que posee las mismas propiedades que una rosa según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 12.

14. Un método para modificar el color floral de una rosa por un efecto de pigmentación conjunta producido por adición de una flavona y una malvidina mediante una técnica de modificación genética, por expresión de un gen de antocianina metiltransferasa, un gen de flavona sintasa, y el gen de la flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa del pensamiento (Viola x wittrockiana) .

15. El método según la reivindicación 14, en el que el efecto de pigmentación conjunta es un efecto de cambio del color floral hacia el azul.