Un procedimiento para purificar el virus de la estomatitis vesicular (VSV) secretado en el fluido del cultivo celular de un cultivo celular de mamífero infectado con el VSV,

que comprende:

(a) aclarado del fluido del cultivo celular mediante centrifugación a baja velocidad y recuperación del VSV del sobrenadante;

(b) filtrado del sobrenadante de la etapa (a) a través de un filtro de 0, 2 a 0, 45 μm y recuperación del VSV en la solución filtrada;

(c) carga de la solución filtrada del VSV en la etapa (b) sobre un adsorbente de membrana de intercambio aniónico equilibrado con una primera solución salina de pH tamponado, elución del VSV en el adsorbente de membrana de intercambio aniónico con una segunda solución salina de pH tamponado, y recuperación de las fracciones eluidas del VSV;

(d) purificación del VSV recuperado en la etapa (c) mediante filtración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de peso molecular límite entre 300 kDa y 1000 kDa y recuperación del VSV en el retenido, y

(e) filtrado del retenido del VSV en la etapa (d) a través de un filtro de 0, 2 a 0, 22 μm y recuperación del VSV en la solución filtrada.

Procedimientos de purificación para el aislamiento del virus purificado de la estomatitis vesicular de un cultivo celular

Antecedentes de la invención

El virus de la estomatitis vesicular (VSV) , miembro de la familia Rhabdoviridae, tiene un genoma de ARN

monocatenario no segmentado de sentido negativo. Su genoma de once kb tiene cinco genes que codifican cinco proteínas estructurales del virus: la proteína de nucleocápside (N) , que se requiere en cantidades estequiométricas para la encapsidación del ARN replicado; la fosfoproteína (P) , que es un cofactor de la ARN polimerasa ARN dependiente (L) ; la proteína matriz (M) y la glicoproteína de enlace (G) (por ejemplo, véase Gallione et al., 1981 J. Virol., 39:529-535; Rose y Gallione, 1981, J. Virol., 39: 519-528; Patente de Estados Unidos Nº 6.033.886; Patente de Estados Unidos Nº 6.168.943) .

En general, el VSV no se considera un patógeno humano, y como tal, la inmunidad preexistente al VSV es rara en la población humana. Así, el desarrollo de vectores derivados del VSV se ha centrado en áreas tales como composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas) y el transporte de genes que codifican las proteínas terapéuticas. Por ejemplo, hay estudios que han establecido que el VSV puede servir como un vector eficaz para 15 expresar la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Roberts et al., 1999 J. Virol., 73:3723-3732) , la proteína del virus H del sarampión (Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74:4652-4657) y las proteínas env y gag del VIH-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106 (5) :539-49) . Otras características del VSV que hacen de él un vector atractivo incluyen: (a) la capacidad de replicarse fuertemente en el cultivo celular; (b) la incapacidad tanto de integrar ADN en la célula huésped como de experimentar recombinación genética; (c) la existencia de múltiples serotipos que posibiliten estrategias de inmunización para estímulos primordiales; (d) se pueden insertar genes extraños de interés en el genoma del VSV y se pueden expresar abundantemente por la transcriptasa viral; y (e) el desarrollo de un sistema especializado para el rescate de virus infecciosos de una copia de ADNc del genoma del virus (por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.033.886; Patente de Estados Unidos Nº 6.168.943) .

La producción de composiciones inmunogénicas vectorizadas del VSV incluyen generalmente la infección de un cultivo celular adecuado (huésped) con VSV recombinante, crecimiento del VSV en el cultivo celular, la cosecha del fluido del cultivo celular en el momento adecuado y la purificación del VSV a partir del fluido del cultivo celular. El uso de vectores del VSV y composiciones inmunogénicas del mismo en aplicaciones clínicas requerirá muestras de VSV (o dosis) de la pureza adecuada para cumplir los requisitos de seguridad de las diversas autoridades de seguridad de fármacos en todo el mundo (por ejemplo, Food and Drug Administration (FDA) , Agencia Europea del Medicamento (EMEA) , Canadian Health Products and Food Branch (HPFB) , etc.) .

Sin embargo, generalmente es difícil separar el VSV de los contaminantes del cultivo celular (por ejemplo, las proteínas y el ADN que son impurezas del cultivo celular) y obtener un VSV de pureza y rendimiento adecuados usando los procedimientos de purificación del VSV disponibles actualmente (por ejemplo, purificación mediante centrifugación en gradiente de sacarosa) . Por ejemplo, usando los procedimientos de purificación disponibles 35 actualmente, generalmente hay una relación inversa entre la pureza y la recuperación (rendimiento porcentual) de las muestras de VSV, haciendo por tanto difícil fabricar cantidades suficientes de VSV purificado. Adicionalmente, en los procedimientos actuales basados en biorreactores, el aumento de las concentraciones celulares y los mayores tiempos de cultivo dan como resultado títulos de VSV superiores, con aumentos concomitantes en los residuos celulares y las concentraciones de constituyentes orgánicos en el fluido del biorreactor, complicando adicionalmente los procedimientos de purificación del VSV.

La ultracentrifugación en gradiente de sacarosa ha sido el procedimiento convencional para purificación de virus (incluyendo la purificación de VSV) desde 1964 (Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34 (5) :1074-1078, 1080; Brown et al., 1967 J. Immun., 99 (1) : 171-7; Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54 (1) :137-44; Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sci. Biol., 17 (6) :295-305) . Sin embargo, mientras las concentraciones del virus 45 aumentan, también se producen aumentos concomitantes de los residuos celulares, del ADN huésped y de las impurezas de proteínas, que son muy difíciles de eliminar en altas concentraciones mediante la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Además, la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa es extremadamente costosa para adaptarla a gran escala. La concentración y purificación del VSV mediante precipitación con polietilenglicol (PEG) (McShany et al., 1970 Virol., 40 (3) :745-6) presenta problemas similares de altos niveles de impureza.

50 Se han obtenido virus de una calidad relativamente alta mediante cromatografía de exclusión de tamaño (Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther., 14 (12) :1139-1153; Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12 (15) :1923-36; Rabotti et al., 1971 Comptes Rendus des Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272 (2) :343-6; Jacoli et al., 1968 Biochim. Biophys. Acta, Genl Subj., 165 (2) :99-302) . Sin embargo, debido al coste del procedimiento y a las dificultades de operación, no es factible, generalmente, para la 55 producción de virus a gran escala. La cromatografía de afinidad, tales como heparina (Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6 (6) :973-985) , lecitinas (Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9; Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5) y sulfato de Matrex™ Cellufine™ (Downing et al., 1992 J. Virol. Meth., 38 (2) :215-228) , ha encontrado alguna aplicación para la purificación de virus. Generalmente, la heparina y la lecitina no se prefieren (o usan) para la producción de virus cGMP debido a posibles problemas de lixiviación, que requerirían ensayos adicionales anteriores al lanzamiento del producto.

La purificación de virus por afinidad utilizando sulfato de Matrex™ Cellufine™ es una cuestión sin resolver, debido a la eficacia en la purificación del virus, calidad del virus y regeneración de la columna. Para la purificación del VSV, se necesitan columnas de afinidad muy grandes (por ejemplo, 0, 2 l de resina de sulfato de Matrex™ 5 Cellufine™ por litro de cultivo celular; resultados no publicados por Wyeth Vaccine) . Se observó un bajo rendimiento de virus al purificar mediante cromatografía de intercambio iónico, tanto de forma individual como en combinación de otros tipos de técnicas cromatográficas tradicionales usadas en la purificación de virus (Publicación de la Patente Internacional Nº WO2006/011580 Specht et al., 2004 Biotech. Bioeng., 88 (4) :465-173; Yamada et al., 2003, citada anteriormente; Vellekamp et al., 2001 citada anteriormente; Zolo-tukhin et al., 1999, citada anteriormente; (Publicación de la Patente Internacional Nº WO1997/06243 Kaarsnaes et al., 1983, citada anteriormente) .

De esta manera, existe una necesidad actual y en desarrollo de la técnica de procedimientos de purificación que puede generar el VSV en un nivel adecuado de pureza y de recuperación (rendimiento) .

Sumario de la invención

Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento se refieren generalmente a los campos de la virología, microbiología, inmunología y desarrollo de procedimientos. Más especialmente, se describen procedimientos de purificación novedosos para obtener el virus de la estomatitis vesicular (VSV) con mayor pureza y rendimiento.

En un aspecto, un procedimiento para la purificación del fluido del cultivo celular del VSV a partir del cultivo celular de un mamífero infectado con el virus VSV comprende las etapas de: (a) aclarado primario, (b) aclarado secundario, (c) adsorción de membrana de intercambio aniónico, (d) filtración de flujo tangencial y (e) filtración. En una realización, la etapa (a) comprende el aclarado del fluido del cultivo celular mediante centrifugación a baja velocidad y recuperación del VSV en el sobrenadante. En una realización, la etapa (b) comprende el filtrado del sobrenadante a través de un filtro de 0, 2 a 0, 45 μm y la recuperación del VSV de la solución filtrada. En otra realización, la etapa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para purificar el virus de la estomatitis vesicular (VSV) secretado en el fluido del cultivo celular de un cultivo celular de mamífero infectado con el VSV, que comprende:

(a) aclarado del fluido del cultivo celular mediante centrifugación a baja velocidad y recuperación del 5 VSV del sobrenadante;

(b) filtrado del sobrenadante de la etapa (a) a través de un filtro de 0, 2 a 0, 45 μm y recuperación del VSV en la solución filtrada;

(c) carga de la solución filtrada del VSV en la etapa (b) sobre un adsorbente de membrana de intercambio aniónico equilibrado con una primera solución salina de pH tamponado, elución del VSV en

el adsorbente de membrana de intercambio aniónico con una segunda solución salina de pH tamponado, y recuperación de las fracciones eluidas del VSV;

(d) purificación del VSV recuperado en la etapa (c) mediante filtración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de peso molecular límite entre 300 kDa y 1000 kDa y recuperación del VSV en el retenido, y (e) filtrado del retenido del VSV en la etapa (d) a través de un filtro de 0, 2 a 0, 22 μm y recuperación del VSV 15 en la solución filtrada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el VSV recuperado en la etapa (e) está libre de contaminantes de proteínas y ácidos nucleicos en el cultivo celular, al menos en un 90, 0% y hasta aproximadamente un 99, 0%.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las células de mamífero se seleccionan de células

renales embrionarias humanas (HEK) , células HEK 293, células ováricas de hamster chino (CHO) , células renales 20 de cría de hamster (BHK) , células renales de mono verde africano (AGMK) y células Vero (AGMK) .

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la centrifugación a baja velocidad es entre 4400 x g y 8000 x g.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que primera solución salina de pH tamponado

o la segunda solución salina de pH tamponado en la etapa (c) se caracteriza independientemente por una o más de 25 las características seleccionas del grupo que consiste en:

(a) contiene una sal seleccionada independientemente entre NaCl o KCl;

(b) contiene una sal con una fuerza iónica de 100 mM a 400 mM;

(c) contiene un una disolución tampón con un pKa entre 6, 0 y 8, 5;

(d) tiene un pH de 6, 5 a 8, 0;

(e) comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en un tampón fosfato, un tampón del ácido N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) o tris- (hidroximetil) -aminometano (TRIS) ; y (f) comprende sacarosa en una concentración del 1, 5% al 5%.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la sal de la segunda solución salina de pH tamponado es NaCl y en el que el VSV se eluye del adsorbente de membrana por la adición de la segunda solución salina de pH

tamponado en una etapa única, en el que la concentración del NaCl en la elución en la etapa única está entre 500 mM y 750 mM.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la segunda solución salina de pH tamponado tiene un caudal de elución de 10 volúmenes de cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la sal de la segunda solución salina de pH tamponado es NaCl

y en el que la fuerza iónica del NaCl en la segunda solución salina de pH tamponado se aumenta linealmente desde 1 mM a 750 mM con un caudal de elución de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la membrana para la filtración de flujo tangencial (TFF) se caracteriza por una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) un peso molecular límite de 300kDa; 45 (b) un peso molecular límite de 750 kDa; y (c) un módulo de membrana de fibra hueca.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la filtración de flujo tangencial (TFF) comprende la concentración del VSV recuperado en la etapa (c) al menos 5 veces, seguido de al menos uno, o al menos cinco intercambios de tampón.

50 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el tampón usado en el intercambio de tampón se caracteriza por una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) un tampón fosfato;

(b) un tampón HEPES;

(c) un tampón TRIS;

(d) una concentración del tampón de 5 mM a 15 mM y un pH de 7, 2 a 7, 5; y

(e) una disolución tampón que comprende adicionalmente NaCl de 100 mM a 200 mM y sacarosa entre un 3, 5% y un 4, 5%.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los procedimientos de la etapas (a) a (e) se llevan a cabo a una temperatura o temperaturas de o entre 15 º C y 25 º C.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el aclarado del fluido del cultivo celular en la etapa (a) se lleva a cabo con un módulo de filtración en profundidad de 1, 0 μm a 4, 5 μm, en el que se omite en la etapa (a) la centrifugación a baja velocidad.

14. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el VSV purificado se formula dando una composición farmacéutica.