PROTEÍNAS RECOMBINANTES CON EFECTO ANTITUMORAL.

Proteínas recombinantes con efecto antitumoral.

La presente invención proporciona una proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:

1 fusionada a través de su extremo N-terminal con una secuencia de localización nuclear, así como una molécula de ADN recombinante que codifica para esta proteína, un vector que comprende dicha molécula de ADN y una célula que comprende dicho vector. Adicionalmente la presente invención está referida a un procedimiento para la obtención de la proteína recombinante y el uso de la misma como agente antitumoral.

Proteínas recombinantes con efecto antitumoral.

La presente invención está relacionada con el campo de la medicina, y particularmente con el campo de la oncología. Específicamente se refiere a proteínas recombinantes con actividad ribonucleolítica que presentan un efecto antitumoral.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Algunas enzimas de la familia ribonucleasa (de ahora en adelante denominada RNasas) han suscitado un especial interés debido a su actividad citotóxica, ya que se podrían usar como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer.

Como ejemplo de RNasa que tienen efecto citotóxico destaca la Onconasa® (de ahora en adelante denominada ONC) , una RNasa procedente de oocitos y embriones tempranos de Rana pipiens que se encuentra en estudios clínicos de fase III como agente antitumoral para el tratamiento de mesotelioma maligno presentando selectividad para células tumorales. Al unirse a la superficie de células tumorales y ser internalizada en el citosol, la ONC causa la muerte celular como resultado de la potente inhibición de la síntesis proteica mediante un mecanismo que implica la degradación del RNA celular. Es conocido que la ONC no es inhibida por el inhibidor proteico de RNasas presente en el citosol de células de mamífero (también denominado IR) , lo que explica la mayor citotoxicidad de la ONC en comparación con otras RNasas de mamífero y, por consiguiente, su efecto antitumoral.

Sin embargo, la ONC presenta propiedades no deseables. Debido a su origen no humano, la ONC típicamente estimula respuestas inmunológicas adversas en el hombre y provoca una elevada toxicidad renal. Además, el hecho de que se obtenga a partir de una fuente natural hace todavía más difícil y caro obtener cantidades suficientes de proteína.

Se han utilizado diversas estrategias para obtener RNasas citotóxicas que superen las deficiencias de la ONC. La mayor parte de estas estrategias han estado enfocadas a la obtención recombinante de RNasas humanas resistentes a la acción del IR gracias a la introducción de mutaciones en su secuencia que provocan una deficiencia en su capacidad de unión al IR.

El trabajo publicado por Bosch et al (Bosch M, Benito B, Ribó M, Puig T, Beaumelle B, Vilanova M. “A Nuclear Localization Sequence Endows Human Pancreatic Ribonuclease with Cytotoxic Activity”. Biochemistr y 2004, vol. 43,

p. 2167-2177) propone una alternativa diferente en tanto que describe una variante de la RNasa pancreática humana (de ahora en adelante RNasa-PH) que, aún siendo sensible al IR, escapa a su acción por ser importada al núcleo, donde el IR no está presente. Esta variante, denominada PE5, incluye mutaciones que determinan la existencia de una señal de localización nuclear bipartita discontinua (Rodríguez M, Benito A, Tubert P, Castro J, Ribó M, Beaumelle B, Vilanova M. “A Cytotoxic Ribonuclease Variant with a Discontinuous Nuclear Localization Signal Constituted by Basic Residues Scattered Over Three Areas of the Molecule”. Journal of Molecular Biology 2006, vol. 360, p. 548-557) . Dicha señal constituye una señal de localización nuclear (de ahora en adelante SLN) no convencional integrada por diferentes residuos básicos, los cuales, a pesar de estar situados en tramos alejados en la secuencia de la proteína, se encuentran próximos en la estructura tridimensional de la misma, lo que permite su interacción con importina alfa y consiguiente importación al núcleo. El resultado es una RNasa modificada con actividad citotóxica frente a líneas celulares de leucemia, carcinoma epidermoide, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma cervical y linfoma de Burkitt, entre otros, siendo más activa en líneas tumorales que presentan un fenotipo de multirresitencia a medicamentos antitumorales.

Ventajosamente, la variante PE5 es de origen humano, por lo que presenta menos efectos secundarios que la ONC y otras RNasas citotóxicas de origen no humano. Sin embargo PE5 presenta una actividad citotóxica poco eficiente. En comparación con la ONC, por ejemplo, la actividad de PE5 es entre 5 y 15 veces menor (Bosch et al, 2004, supra) . La baja eficiencia de PE5 condicionaría un incremento en el coste del tratamiento antitumoral y podría provocar la aparición de otros efectos secundarios dado que serían necesarias dosis más elevadas.

A pesar de los avances antes descritos, es deseable proporcionar agentes y tratamientos más eficientes para los enfermos de cáncer con menos efectos secundarios y a un coste más asequible.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han desarrollado variantes de la RNasa-PH con elevado efecto citotóxico que permiten proporcionar a los enfermos de cáncer un tratamiento antitumoral eficiente, con menos efectos secundarios.

Los inventores han encontrado, sorprendentemente, que la incorporación de una SLN en el extremo N-terminal de la secuencia de una variante de RNasa-PH definida por la SEC ID NO: 1 resulta en una nueva RNasa recombinante con un efecto citotóxico diez veces superior a la variante original.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante con actividad RNasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1 fusionada a través de su extremo N-terminal con una SLN, siendo la SEC ID NO: 1

KESAAAKFXRQHMDSXXSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQGRCKPVNTFVHEPLVDVQNVCFQEKVTCKNGQGNCYK SNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHIIVACEGSPYVPVHFDASVEDST, donde

X9 es ácido glutámico (E) o glutamina (Q) ,

X16 es glicina (G) o ácido aspártico (D) , y

X17 es asparaguina (N) o serina (S) .

Las proteínas recombinantes de la invención son casi idénticas a la RNasa-PH salvaje, por lo que presentan menos efectos adversos que la ONC, a la vez que ejercen un efecto citotóxico comparable a ésta y muy superior a las variantes de las que derivan.

Debido a su efecto citotóxico, las proteínas recombinantes de la invención son útiles como medicamento, en concreto como agentes antitumorales para el tratamiento del cáncer. Así, un segundo aspecto proporciona una proteína recombinante según se define en el primer aspecto de la invención, para uso como medicamento.

De cara a un uso médico, es habitual que los agentes activos sean formulados en composiciones farmacéuticas que contienen excipientes adecuados para su administración en humanos. Así, un tercer aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante definida en el primer aspecto de la invención junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un procedimiento para la construcción de una proteína recombinante de acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende: a) introducir la secuencia del gen que codifica para la RNasa-PH (nº genbank Gene ID: 6035, actualizado el 13 de enero de 2011) en un vector de expresión, donde dicho vector contiene los elementos necesarios para llevar a cabo la expresión del gen contenido en dicho vector; b) incorporar en el vector resultante del paso (a) una cadena de nucleótidos que codifica para una SLN en el extremo del gen que codifica para la región N-terminal de la RNasa-PH, donde dicha incorporación se lleva a cabo mediante técnicas de mutagénesis en cassette; c) inducir modificaciones en el vector resultante del paso (b) de modo que se obtiene una nuevo vector que comprende la secuencia que codifica para la proteína recombinante definida de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichas modificaciones se llevan a cabo mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido; y d) llevar a cabo la expresión de la secuencia que codifica para la proteína recombinante definida en la reivindicación 1 a partir del vector resultante del paso (c) .

La proteína recombinante resultante del paso (d) puede ser posteriormente purificada mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Como ejemplo, la purificación de RNasas recombinantes se describe en Ribó M, Benito A, Canals A, Nogués MV, Cuchillo C, Vilanova M. “Purification of engineered human pancreatic ribonuclease”. Methods in Enzymology 2001, vol. 341, p. 221-234.

Así, la proteína recombinante con actividad RNasa de la presente invención puede prepararse mediante la expresión en fase de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para... [Seguir leyendo]

1. Proteína recombinante con actividad ribonucleasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1

fusionada a través de su extremo N-terminal con una secuencia de localización nuclear, siendo la SEC ID NO: 1 KESAAAKFXRQHMDSXXSPSSSSTYCNQMMRRRNMTQGRCKPVNTFVHEPLVDVQNVCFQEKVTCKNGQGNCYK SNSSMHITDCRLTNRRRYPNCAYRTSPKERHIIVACEGSPYVPVHFDASVEDST, donde

X9 es ácido glutámico (E) o glutamina (Q) , X16 es glicina (G) o ácido aspártico (D) , y X17 es asparagina (N) o serina (S) .

2. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia de localización nuclear se selecciona del grupo que consiste en las secuencias SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.

3. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde X9 es ácido glutámico (E) , X16 es glicina (G) , y X17 es asparagina (N) .

4. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en la secuencia SEC ID NO: 10.

5. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde X9 es glutamina (Q) , X16 es ácido aspártico (D) , y X17 es serina (S) .

6. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, que consiste en la secuencia SEC ID NO: 14.

7. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, junto con cantidades suficientes de excipientes farmacéuticamente aceptables.

8. Proteína recombinante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso como medicamento.

9. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, para uso como agente antitumoral.

10. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de cáncer con fenotipo de multiresistencia a medicamentos.

11. Proteína recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 9-10, para uso en el tratamiento del cáncer de ovario, pulmón y mama.

12. Proteína recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, para uso en combinación con otro agente antitumoral.

13. Uso de la proteína recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

14. Procedimiento para la construcción de una proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

a) introducir la secuencia del gen que codifica para la RNasa-PH (gene ID: 6035, fecha de actualización 13 de enero del 2011) en un vector de expresión, donde dicho vector contiene los elementos necesarios para llevar a cabo la expresión del gen contenido en dicho vector;

b) incorporar en el vector resultante del paso (a) una cadena de nucleótidos que codifica para una secuencia de localización nuclear en el extremo del gen que codifica para la región N-terminal de la RNasa-PH, donde dicha incorporación se lleva a cabo mediante técnicas de mutagénesis en casette; c) inducir modificaciones en el vector resultante del paso (b) de modo que se obtiene una nuevo vector que comprende la secuencia que codifica para la proteína recombinante definida de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichas modificaciones se llevan a cabo mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido; y

d) llevar a cabo la expresión de la secuencia que codifica para la proteína recombinante definida en la reivindicación 5 1 a partir del vector resultante del paso (c) .

15. Molécula de ADN aislada que codifica para la proteína recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

16. Molécula de ADN aislada de acuerdo con la reivindicación 15 que codifica para la proteína recombinante seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 14.

17. Molécula de ADN aislada de acuerdo con la reivindicación 16 que consiste en SEC ID NO 15 y la SEC ID NO: 16

18. Vector de expresión que comprende una molécula de ADN como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

19. Célula hospedadora que comprende el vector de expresión definido en la reivindicación 18.

FIG. 1

A

B

FIG. 2

FIG. 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9

FIG. 4

1 2 3