Promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácidonucleico y está compuesto por varios elementos y comprende un promotor mínimo,

así como al menos unelemento cis-regulador corriente arriba del promotor mínimo, caracterizado porque el promotor mínimopresenta un motivo de secuencia dbrmwa dispuesto corriente abajo de una región TATA y antes de un puntode inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácidonucleico que se tiene que regular y en el que el promotor sintético inducible por patógenos presenta ademásdel promotor mínimo al menos un elemento cis-regulador con una secuencia de nucleótidos según una de lasSEC. ID. Nº 10-15.

Promotor sintético inducible por patógenos

La presente invención se refiere a un promotor sintético inducible por patógenos, que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácido nucleico y comprende un promotor mínimo. Además, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica, así como a plantas transgénicas.

Se conocen diferentes procedimientos para la obtención de plantas resistentes contra patógenos como hongos, virus, bacterias y nematodos. Algunos de estos procedimientos emplean la reacción de hipersensibilidad (RH) de la planta, produciéndose la formación de necrosis en los puntos de contacto directo entre patógeno y planta. A consecuencia de la RH, en las células vecinas se inicia un amplio espectro de medidas de defensa contra patógenos, las cuales impiden que continúe el avance del patógeno en el tejido vegetal.

La RH se puede producir tras la expresión de genes efectores, como por ejemplo genes de avirulencia de un patógeno y la interacción con el producto de un gen de resistencia correspondiente (gen R) . Así, el gen R puede existir en la planta o se puede insertar en el correspondiente genoma vegetal mediante métodos de ingeniería genética (Stuiver y col. 1998, Keller y col., 1999, Belbahri y col., 2001) . Además, una sobreexpresión o autoactivación de los genes R puede conducir a la activación de una RH (Tao y col., 2000, Tang y col., 1999, Bendahmane y col., 2002, Howles y col., 2005) . Mediante la sobreexpresión de un gen R se sobrepasa un valor límite que conduce a la activación de una cascada de señales que normalmente sólo se desencadena por la presencia del patógeno o sus productos del gen de avirulencia. Mediante la activación de esta cascada se puede obtener una resistencia de amplia eficacia contra patógenos (Oldroyd y Staskawicz, 1998, Tang y col., 1999, Tao y col., 2000, Howles y col., 2005) . Como genes R autoactivos se describen aquellos genes R que se modificaron hasta el punto que para la activación de nuevo de la cascada de señales no es necesaria la presencia del patógeno/producto del gen de avirulencia y al mismo tiempo es suficiente una cantidad de expresión reducida en comparación con la forma no modificada, para conseguir la activación de la cascada de señales.

Stuiver y col. (1998) pudo mostrar que la transformación del gen avr9 del hongo fitopatógeno Cladosporium fulvum bajo el control del promotor Gst1 inducible por patógenos procedente de la patata en plantas de tomate que llevan el gen Cf9 correspondiente condujo a una resistencia a los hongos de amplia eficacia. Se pudo obtener una resistencia contra los oomicetos Phytophthora parasitica var nicotianae en Nicotiana tabacum, después se transformó el eleicitor criptogeína de P. cr y ptogea o el elicitor bacteriano popA de la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum en N. tabacum. Ambos genes estuvieron bajo el control del promotor inducible por patógenos hsr203J de N. tabacum (Keller y col., 1999, Belbahri y col., 2001) .

El sistema de la activación de la RH requiere un control estricto de la expresión del gen efector en el lugar de la infección. En la expresión incontrolada, la expresión del gen efector provoca efectos negativos en el crecimiento de las plantas y por tanto en el rendimiento de los cultivos (Stuiver y Custers, 2001) . No obstante, se puede realizar unaexpresión controlada mediante la selección de promotores adecuados inducibles por patógenos. Éstos no deberían permitir ninguna expresión o permitir sólo una expresión baja en condiciones sin ataque, aunque en caso de ataque inducen una expresión claramente mayor en el lugar de la infección. Tras la transformación de dos formas autoactivas diferentes del gen de resistencia a la roya L6 del lino (Linum usitatissimum) en lino bajo el control del promotor natural Fis1 del lino inducible por roya se pudieron determinar dos fenotipos. Por un lado, las plantas de crecimiento normal que no mostraron ninguna resistencia mejorada contra patógenos, por otro lado las plantas de bajo crecimiento con amplia resistencia contra patógenos (Howles y col., 2005) . Estos resultados muestran que según la forma empleada del gen R autoactivo se produce una actividad del promotor que se puede encontrar ya por encima del valor límite de inducción de la cascada de señales, mientras en las plantas fenotípicamente discretas la inducción del promotor Fis1 no basta para conseguir el valor límite. Por tanto, la especificidad del promotor Fis1 natural no es suficiente para conseguir una resistencia de amplia eficacia frente a patógenos sin efectos negativos en el crecimiento de la planta.

Los promotores naturales inducibles por patógenos muestran a menudo una actividad demasiado inespecífica y son activados por numerosos estímulos, de modo que su uso para la expresión de los genes efectores mencionados arriba no tiene sentido, ya que también se puede producir una activación RH bajo condiciones sin infección. Esta fuga de los promotores conduce a una afectación del crecimiento de la planta y por tanto a una reducción de la cosecha en plantas cultivadas. Por consiguiente, se han desarrollado promotores sintéticos que contienen motivos de secuencia (elementos cis-reguladores) procedentes de promotores naturales inducibles por patógenos que son relevantes para la inducción por patógenos. Por el contrario, se eliminan los motivos de secuencia para otros estímulos. Los elementos cis-reguladores se clonaron corriente arriba de un promotor mínimo, de modo que se consiguió un promotor funcional que presenta una elevada especificidad en comparación con los promotores naturales a partir de los cuales se aislaron los correspondientes elementos cis-reguladores (Rushton y col., 2002) . Como promotor mínimo para plantas dicotiledóneas se empleó el intervalo -46 a +8 del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor. Además, se conoce el uso de un promotor mínimo a partir de un promotor natural, del que se clonó el correspondiente elemento cis-regulador (Perl-Treves y col., 2004) . Para plantas monocotiledóneas se describe el uso del promotor mínimo del gen Act1 del arroz (Lü y col., 2000) .

Aunque los promotores sintéticos descritos son superiores a los promotores naturales, siguen mostrando actividad de fondo, incluso en condiciones sin ataque. Esta actividad de fondo fluctúa entre tipos de plantas individuales. Así, en todos los tipos de plantas estudiados hasta ahora se ha podido constatar inducibilidad por patógenos, aunque fluctúan las intensidades de la inducción y la actividad absoluta de los promotores. Así, debido a una actividad de fondo demasiado intensa en tejidos no infectados sólo se puede determinar una baja inducibilidad por patógenos como cociente de la actividad del promotor en el tejido infectado dividido por la actividad del promotor en el tejido no infectado.

Hasta ahora sólo se ha hecho responsables de la cantidad de actividad de fondo de un promotor sintético a loselementos cis-reguladores usados. Éstos tienen una influencia muy grande en la fuerza del promotor (Rushton y col., 2002) . La influencia del promotor mínimo se ha estudiado poco hasta ahora. Según los datos bibliográficos el promotor mínimo tiene muy poca influencia en la regulación de la actividad del promotor (Singh, 1998) . Sin embargo, Bhullar y col. (2003) pudieron observar una clara reducción de la actividad promotora del promotor 35S cuando se intercambió el promotor mínimo (-46 bis +1) por promotores mínimos vegetales heterólogos. Estas diferencias se atribuyeron a secuencias diferentes de la caja TATA, mientras en su opinión las regiones que flanquean la caja TATA del promotor mínimo no fueron relevantes para la actividad del promotor.

Por tanto, es objeto de la presente invención proporcionar un promotor sintético inducible por patógenos con baja actividad de fondo.

Según la invención el objetivo propuesto se alcanza mediante un promotor sintético inducible por patógenos con un promotor mínimo, presentando el promotor mínimo un motivo de secuencia dbrmwa que está dispuesto corriente abajo de una región TATA y antes de un punto de inicio de transcripción situado sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular y en el que el promotor sintético inducible por patógenos presenta junto al promotor mínimo al menos un elemento cis-regulador con una secuencia de nucleótidos según una de las SEC. ID. Nº: 10 – 15.

Los símbolos de los motivos de secuencia tienen el significado siguiente:

d = nucleótido a o g o t/u... [Seguir leyendo]

1. Promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácido nucleico y está compuesto por varios elementos y comprende un promotor mínimo, así como al menos un 5 elemento cis-regulador corriente arriba del promotor mínimo, caracterizado porque el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia dbrmwa dispuesto corriente abajo de una región TATA y antes de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular y en el que el promotor sintético inducible por patógenos presenta además del promotor mínimo al menos un elemento cis-regulador con una secuencia de nucleótidos según una de las

10 SEC. ID. Nº 10-15.

2. Promotor sintético inducible por patógenos según la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor sintético inducible por patógenos con el motivo de secuencia dbrmwa provoca una actividad promedio del gen reportero en plantas de patata transgénicas no infectadas, la cual es inferior en comparación con un promotor sintético

inducible por patógenos con un promotor mínimo 35S.

3. Promotor sintético inducible por patógenos según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el motivo de secuencia aparece dos o más veces en el promotor mínimo.

4. Promotor sintético inducible por patógenos según una de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en el que el promotor mínimo presenta una secuencia de nucleótidos según una de las SEC. ID. Nº 1-7.

5. Gen recombinante con un Promotor sintético inducible por patógenos según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

6. Células vegetales transgénicas en las que un promotor sintético inducible por patógenos según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4 se integra en el ADN de la célula vegetal.

7. Planta transgénica con una célula vegetal según la reivindicación 6.

8. Semilla transgénica con una célula vegetal según la reivindicación 6.

Fig. 3

1º

Inducción (infectado / control)

1.000

395, 2 332, 5

180, 4

158, 6

46, 7 41, 2 36, 3 10, 0

1 StPSBR NtTGAA StGst NtRBS Nt5EAS NpATP2 NpCABE 35 S

Fig. 4

Fig. 5 35S NtTGAA NpCABE

Promotor minimo

Fig. 6

ubi TaPAL TaACS

Fig. 7

Kan (nptIII) RB nosT

luc-m3 Promotor minimo 35S 4xGst1 nos-Pro nptII LB

Fig. 8

caja TATA

Fig. 9