Promotor que comprende una secuencia de nucleótidos según SEC.

ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1, presentando el promotor una actividad específica del tejido y siendo más activo en las células del parénquima xilemático de las raíces de la planta que en otras células de la planta.

Promotor específico de las raíces y específico del parénquima xilemático La presente invención se refiere a un promotor y a su uso, así como a plantas transgénicas.

Las plantas superiores contienen un sistema de conductos, el xilema, en el que tiene lugar el transporte ascendente de agua y sales nutritivas.

La carga del xilema en la raíz se regula mediante el parénquima xilemático, que cubre las fibras de xilema. Por tanto, las células del parénquima xilemático de las raíces representan un punto de control importante para la entrada de sustancias en el xilema. Las células del parénquima xilemático contienen para este fin bombas de protones específicas, canales de agua y canales de iones.

Con su importancia fisiológica para el metabolismo, el parénquima xilemático abre una serie de posibilidades de realizar modificaciones genéticas en las plantas. Las influencias en el transporte de nutrientes se podrían realizar, por ejemplo, mediante determinadas proteínas, que son activas principalmente en el parénquima xilemático.

Ya se conocen promotores que son activos, entre otras, en las células del parénquima xilemático. De hecho, ni la actividad de estos promotores se limita exclusivamente a las células del parénquima xilemático (documento EP 1 207 204 A1) , ni los promotores son activos principalmente en las raíces. Así, la actividad del promotor Sultr2.1 también se puede detectar en el floema de las hojas (Takahashi y col. 2000) y el promotor SOS1 también está activo en las células terminales de las puntas de las raíces (Shi y col., 2002) . El promotor I2 del gen de resistencia I2 del tomate está activo principalmente en las células del parénquima xilemático del brote y al mismo tiempo también en la raíz, la hoja y el fruto del tomate (Mes y col., 2000) . El transportador de aminoácidos AAP6 de alta afinidad procedente de A. thaliana se expresa en las células del parénquima xilemático de todos los vasos de la raíz y la hoja a través del promotor AAP6 (Okumoto y col., 2002) . Los análisis Blot de ARN muestran que el gen AAP6 se expresa intensamente en raíces, hojas caídas y hojas caulinares y se expresa débilmente en brotes y flores (Rentsch y col. 1996) .

Sakuta y Satoh, 2000, describen proteínas CRGRP ricas en glicina cuya función fisiológica aún no está clara, suponiéndose que las proteínas CRGRP contribuyen a reforzar la pared de los vasos del xilema. Kloos y col., 2002, describen entre otras cosas el aislamiento y el análisis molecular del gen de una proteína "similar a la taumatina" (Tlp) procedente de la remolacha azucarera, que se expresa específicamente en la raíz pivotante. En ambos documentos los promotores no se conocen. Por tanto, es objetivo de la presente invención influir en los rendimientos metabólicos de una planta específicamente en la zona del parénquima xilemático de las raíces.

Según la invención, el objetivo propuesto se alcanza mediante un promotor conforme a las características de la reivindicación 1.

Algunos de los términos usados en esta solicitud se explican más detalladamente a continuación:

Se entiende por promotor una secuencia de ácidos nucleicos que controla la expresión de un gen, dado el caso dependiendo de factores endógenos y exógenos. Entre estos factores se cuentan, por ejemplo, inductores, represores y proteínas similares que se unen al ADN, aunque también influencias ambientales. Un promotor puede constar de varios elementos. Sin embargo, comprende al menos un elemento regulador que es responsable de la transcripción del gen que se encuentra bajo su control.

Un promotor que es más activo en las células del parénquima xilemático de las raíces de la planta que en otras células de la planta presenta, por ejemplo en las raíces, una actividad medible mediante Blot de ARN, que para condiciones de ensayo comparables se puede detectar un 20% menos, preferiblemente un 10% menos y en particular un 5% menos en órganos superficiales de las plantas, como peciolos, hojas y flores. Esta especificidad no se limita a un determinado momento del ensayo sino que se da fundamentalmente durante todo el tiempo de vegetación.

Son "derivados" de un promotor las versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos de este promotor con las mismas propiedades o propiedades esencialmente iguales.

"Inducibilidad por patógenos" representa el efecto de factores externos en una planta, que provocan una reacción de defensa en la misma. Así, puede tratarse de ataques de insectos (mordiscos) , bacterias, hongos, nematodos u otros patógenos, pero también de efectos abióticos, como heridas mecánicas o estrés hídrico o salino.

"Efecto antifúngico directo" significa que los productos génicos actúan directamente como antifúngicos, de modo que, por ejemplo, disuelven paredes celulares o codifican para fitoalexina sintasas o para metabolitos que actúan inhibiendo el metabolismo de los hongos.

"Efecto antifúngico indirecto" significa que los productos génicos activan las defensas génicas vegetales. A estos genes pertenecen, por ejemplo, los genes de resistencia, componentes de la transducción de señal (como quinasas, fosfatasas) , factores de transcripción o enzimas que producen sustancias señal (como enzimas formadores de etileno, formadores de ácido salicílico o formadores de jasmonato, enzimas formadores de especies de oxígeno reactivas, enzimas formadores de monóxido de nitrógeno) .

Por "infección" se entiende el instante de tiempo más temprano en el que el metabolismo del hongo (o el crecimiento del hongo) se prepara para una penetración del tejido huésped. A ésta pertenecen, por ejemplo, el crecimiento de hifas o la formación de estructuras de infección específicas, como las hifas de penetración y los apresorios.

La expresión "homología" representa aquí una homología de al menos el 70% a nivel de ADN, que se puede determinar según procedimientos conocidos, por ejemplo, la comparación de secuencias computerizada (S. F. Altschul y col., 1990) , la herramienta de búsqueda Basic Local Alignment, J. Mol. Biol. 215: 403-410) .

"Secuencia de nucleótidos complementaria" significa, referido a ADN bicatenario, que la segunda cadena de ADN complementaria a la primera cadena de ADN según las reglas de combinación de bases presenta bases nucleótidas que se corresponden con las bases de la primera cadena.

El término aquí empleado "hibridar" significa hibridar bajo condiciones convencionales, como las descritas por Sambrook y col. (1989) , preferiblemente bajo condiciones astringentes. Por ejemplo, son condiciones de hibridación astringentes: hibridación en 4 x SSC a 65º C y a continuación lavados múltiples en 0, 1 x SSC a 65º C durante un total de aproximadamente 1 hora. Son condiciones de hibridación menos astringentes, por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 37º C y a continuación lavados múltiples en 1 x SSC a temperatura ambiente. "Condiciones de hibridación astringentes" también puede significar: hibridar a 68º C en fosfato sódico 0, 25 M, pH 7, 2, SDS 7%, EDTA 1 mM y BSA 1% durante 16 horas y a continuación doble lavado con 2 x SSC y SDS 0, 1% a 68º C.

La invención se describe más detalladamente a continuación y haciendo referencia a las figuras y ejemplos.

El promotor según la invención está activo en células del parénquima xilemático de las raíces de plantas. Por el contrario, en los órganos superficiales de la planta en cuestión no se detecta actividad, o sólo muy baja. Esta propiedad se puede utilizar para la mejora de los procesos de carga y descarga del xilema de la raíz y por tanto, para la mejora del metabolismo. Por eso, usando el promotor se pueden preparar también plantas transgénicas y partes de estas plantas, como semillas.

El promotor según la invención se puede emplear para mejorar el metabolismo del nitrógeno de las plantas. Para ello se sobre-expresan genes de proteínas de transporte para nitrato y aminoácidos en las células del parénquima xilemático y se refuerza la carga del xilema con los compuestos de N. Otra mejora del metabolismo del N supone el depósito reducido de "nitrógeno dañino" en los órganos de almacenamiento de la planta. Altas concentraciones de compuestos de N en los órganos de almacenamiento a menudo reducen el valor fisiológico alimentario de productos de cultivo o dificultan el aislamiento de sustancias de almacenamiento como sucrosa a partir de las raíces de la... [Seguir leyendo]

1. Promotor que comprende una secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1, presentando el promotor una actividad específica del tejido y siendo más activo en las células del parénquima xilemático de las raíces de la planta que en otras células de la planta.

2. Versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 1, que presentan una actividad específica del tejido y son más activas en las células del parénquima xilemático de las raíces de la planta que en otras células de la planta.

3. Vector o elemento genético móvil que contiene un promotor según la reivindicación 1 o versiones acortadas

o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 2.

4. Célula huésped eucariótica o procariótica que se transforma con un promotor según la reivindicación 1 o versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 2.

5. Planta transgénica o partes de la misma que se transforman con un promotor según la reivindicación 1 o versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 2.

6. Planta transgénica según la reivindicación 5, caracterizada porque la planta es Beta vulgaris.

7. Semillas transgénicas de plantas según la reivindicación 5 o 6, transformándose las plantas con un promotor según la reivindicación 1 o versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 2.

8. Uso de un promotor según la reivindicación 1 o de versiones acortadas o alargadas o idénticas sección por sección u homólogos con al menos un 70% de homología a nivel de ADN de un promotor según la reivindicación 2 para la preparación de una planta transgénica con una o varias de las propiedades siguientes:

a. Procesos mejorados de carga y descarga del xilema en la raíz

b. Abastecimiento mejorado de nitrógeno

c. Acumulación reducida de "nitrógeno dañino" en la raíz

d. Resistencia mejorada a la sal

e. Resistencia mejorada al estrés por sequedad

f. Tolerancia mejorada al hielo

g. Concentración Na+/K+ modificada en la raíz

h. Aumento de la resistencia/tolerancia frente a patógenos

Figura 1

Pvull (533) Amp Hin dlll (659)

Sacl (1709)

Promoter 2-1-88

Pvull (5517)

Kpnl (5299)

Terminator Ndel (2332) S Promotor 2-1-88

Ncol (3197)

GUS

Terminador Figura 2

Pvu ll (533)

Sac l (1709)

Hin dlll (659) Eco Rl (760) Xbal (938)

Amp

Promotor 2-1-88

Pvu ll (5382)

NOS Terminador

Ndel (2332) Kpnl (4869)

S al (2381)

S al (4863) Sac l (4860)

Ncol (3197)

LUC

Figura 3

28. 291 (+) 295-299 (+) .

29. 300 (-) 341-345 (-) .

41. 419 (-) 455-458 (-) .

58. 591 (-) 627-631 (-) .

67. 682 (+) 789-794 (-) .

98. 990 (+) W-Box NPR1 804-808 (+) 1023-1027 (-) 2269-2273 (-) 2448-2452 (+) MY.

16. 171 (-) 794-799 (-) 825-830 (-)

W-Box

22. 227 (+)

TAT.

3. 41

82. 830 (+) PAL-Box.

36. 369 (-) .

57. 579 (+) Aux-IAA.

49. 497 (-)

Figura 4

PstI (2006)

Eco RI (15430)

POLY A

gus Nco I (4907) Nco I (13291)

NcoI (5435)

Nos Sma I (12760)

LUC (11095-12744)

PstI (7741) Sma I (10278) Nco I (7925)

Promotor 2-1-88 (8556-11093) Eco RI (8657) nos-Pro

Hin dIII (8556)

Figura 5

Figura 6 Figura 7 Figura 8

floe a/xile a

Figura 9

Xma I (48)

Figura 10