Producción de VAA recombinantes de alto título.

Procedimiento para producir virus adenoasociado recombinante de alto título (VAAr),

que comprende: (a) coinfectar simultáneamente una célula 293 con (i) un primer virus de herpes simple recombinante (VHSr) de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende los genes rep de VAA y cap de VAA, estando cada uno funcionalmente unido a un promotor, y (ii) un segundo VHSr de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende dos repeticiones terminales internas (ITR) de VAAr, un gen de interés, y un promotor funcionalmente unido a dicho gen de interés, en el que el gen está flanqueado por las ITR; (b) incubar la célula 293; y (c) tras la incubación, recoger los VAAr de la célula 293 de la etapa (b) en la que se producen entre 2.300 y 6.000 partículas infecciosas por célula infectada.

Producción de VAA recombinantes de alto título.

1.0 Antecedentes de la invención

1.1 Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos para la producción a gran escala de virus adenoasociado recombinante (VAAr) para su utilización en aplicaciones de terapia génica.

1.2 Descripción de la técnica relacionada La terapia génica se refiere al tratamiento de enfermedades genéticas sustituyendo, alterando o complementando un gen responsable de la enfermedad. Esto se consigue mediante la introducción de un gen o genes correctores en una célula huésped, generalmente por medio de un vehículo o vector. La terapia génica es muy prometedora para el tratamiento de muchas enfermedades. Ya ha conseguido cierto éxito de manera preclínica utilizando AVV recombinantes (VAAr) para la inserción y la expresión a largo plazo de genes introducidos en células en animales, incluyendo células que no se dividen clínicamente importantes del cerebro, hígado, músculo esquelético y pulmón. Los ensayos clínicos que utilizan esta tecnología han incluido la utilización de VAAr que expresan el gen cftr como tratamiento para la fibrosis quística (Flotte et al., 1998; Wagner et al. 1998) .

Se han desarrollado procedimientos para producir VAAr en los que se hace que células que se han hecho crecer en cultivo produzcan VAA, que luego se recogen de las células y se purifican. Los procedimientos de producción para VAA implican la inserción de tres elementos necesarios para las células productoras: 1) un gen de interés flanqueado por secuencias de repetición terminal invertidas (ITR) de VAA, 2) genes rep y cap de VAA, y 3) proteínas víricas auxiliares ("funciones auxiliares") . El protocolo convencional para insertar los dos primeros es mediante transfección de las células con ADN de plásmido que contiene los casetes génicos recombinantes apropiados. Las funciones auxiliares se han insertado tradicionalmente infectando las células con un virus auxiliar tal como adenovirus (Ad) . (Samulski et al., 1.998; Hauswirth et al., 2000) .

El documento WO95/06743 describe un procedimiento para producir viriones de VAA recombinantes, que comprende introducir en una célula huésped un vector de VAA recombinante, infectar la célula con adenovirus recombinante o virus de herpes que pueden expresar una proteína de VAA esencial y cultivar la célula para producir viriones de VAA.

1.3 Problemas cuantitativos asociados con la producción de cantidades de VAAr necesarias para la terapia génica A pesar de los beneficios potenciales de la terapia génica como tratamiento para enfermedades genéticas humanas, una grave limitación práctica obstaculizan su utilización extendida en la clínica. Con el fin de producir incluso una dosis única clínicamente eficaz para un paciente humano, deben prepararse más de 1014 partículas de VAAr (Sny der, et al., 1997; Ye et al., 1999) . Preparar este número de partículas utilizando la tecnología actual requiere más de 2 x 1011 células productoras. A escala de laboratorio, este número de células requeriría aproximadamente 7500 matraces de cultivo tisular. A escala comercial, este nivel de cultivo celular plantea una grave barrera práctica para la producción a gran escala de VAAr en "fábricas celulares".

Los beneficios de mejora el rendimiento de partículas por célula serán muy significativos desde un punto de vista de la producción comercial. Por ejemplo, una mejora que dé como resultado un aumento de dos veces en el rendimiento de VAAr por célula permitiría cultivar la mitad de células. Un aumento de diez veces permitiría que se preparase la misma cantidad de producto de VAAr en una décima parte del número de células productoras. Se requieren mejoras significativas de esta magnitud con el fin de conseguir una viabilidad económica para esta tecnología.

Las metodologías de producción de VAAr actuales utilizan procedimientos conocidos para limitar el número de VAAr que puede producir una única célula productora. El primero de éstos es la transfección utilizando plásmidos para la inserción de ADN en las células. Se conoce bien que la transfección de plásmidos es un proceso inherentemente ineficaz que requiere un alto número de copias del genoma y por tanto grandes cantidades de ADN (Hauswirth et al., 2000) . Adicionalmente, la utilización de Ad reduce significativamente los títulos de VAAr finales porque es un contaminante que debe retirarse del producto final. No sólo deben emplearse procedimientos eficaces para eliminar la contaminación por Ad, sino que también son necesarios ensayos rigurosos para determinar la contaminación por Ad de VAAr. Los procedimientos de purificación y seguridad dictados por la utilización de Ad dan como resultado la pérdida de VAAr en cada etapa. Por tanto, deben desarrollarse procedimientos prácticos desde el punto de vista comercial que superen estas barreras para proporcionar VAAr en las enormes cantidades requeridas para aplicaciones clínicas.

2.0 Sumario de la invención La presente invención trata de superar algunas de las deficiencias en la técnica anterior abordando los problemas que limitan la producción de VAAr en cantidades suficientes para procedimientos de terapia génica eficaces. En la invención, se obtienen altos títulos de VAAr infeccioso que son al menos un orden de magnitud mayor que los notificados previamente.

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir virus adenoasociado recombinante (VAAr) de alto título que comprende: (a) coinfectar simultáneamente una célula 293 con (i) un primer virus de herpes simple recombinante (VHSr) de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende un gen rep de VAA y uno cap de VAA, estando cada uno funcionalmente unido a un promotor, y (ii) un segundo VHSr de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende repeticiones terminales internas (ITR) de VAAr, un gen de interés, y un promotor funcionalmente unido a dicho gen de interés, en el que el gen está flanqueado por las ITR; (b) incubar la célula 293; y (c) tras la incubación, recoger los VAAr de la célula 293 de la etapa (b) en la que se producen 2.300-6.000 partículas infecciosas por célula infectada.

La invención se refiere a un procedimiento para producir VAAr de alto título. En el procedimiento, las células productoras se coinfectan simultáneamente con al menos dos virus de herpes simple recombinantes (VHSr) . Los dos VHSr son vectores diseñados para dotar a las células, tras la infección, de todos los componentes necesarios para producir VAAr.

La infección de las células productoras con VHSr que no pueden replicarse se utiliza porque, a diferencia de los procedimientos que implican la utilización de adenovirus, el VHSr no se convierte en un contaminante significativo del producto de VAAr. Esto aumenta el rendimiento final de VAAr eliminando las etapas de purificación asociadas con la eliminación de Ad. En una realización particular de la invención, se construyó el VHSr a partir de un mutante de VHS-1 en el que la incapacidad para replicarse se debe a una mutación en el gen ICP27. También puede utilizarse cualquier otro mutante de VHS que muestre un fenotipo de replicación defectuosa para construir el VHSr.

Una realización de la invención implica infección de una célula productora con dos vectores de VHSr diferentes. El primer vector de VHSr contiene los genes rep y cap de VAA incluyendo los hallados en diversos serotipos de VAA incluyendo VAA-1, VAA-2, VAA-3, VAA-4, VAA-5 y VAA-6, VAA-7 y VAA-8, y variantes de tales genes, por ejemplo, los de otros serotipos de VAA y los preparados mediante recombinación o mutación de los genes rep y/o cap de los serotipos anteriores.

En determinadas formas de realización, los genes rep y cap de VAA-2 en el primer VHSr pueden dirigirse mediante sus promotores nativos, y se inserta el constructo génico en el gen tk del virus VHSr. También pueden utilizarse cualquier otro sitio o sitios en el genoma de VHS adecuado (s) para la integración de los genes rep y cap. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores heterólogos para dirigir la expresión de los genes de VAA. Los ejemplos de otros promotores que pueden utilizarse en el procedimiento dado a conocer incluyen pero no se limitan al promotor precoz de SV40, promotor de CMV, promotor de tk de herpes, promotor inducible de metalotionina, promotor de virus de tumor mamario de ratón y promotor de β-actina... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir virus adenoasociado recombinante de alto título (VAAr) , que comprende: (a) coinfectar simultáneamente una célula 293 con (i) un primer virus de herpes simple recombinante (VHSr) de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende los genes rep de VAA y cap de VAA, estando cada uno funcionalmente unido a un promotor, y (ii) un segundo VHSr de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico que comprende dos repeticiones terminales internas (ITR) de VAAr, un gen de interés, y un promotor funcionalmente unido a dicho gen de interés, en el que el gen está flanqueado por las ITR; (b) incubar la célula 293; y (c) tras la incubación, recoger los VAAr de la célula 293 de la etapa (b) en la que se producen entre 2.300 y 6.000 partículas infecciosas por célula infectada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen cap de VAA presenta un serotipo seleccionado de entre el grupo constituido por VAA-1, VAA-2, VAA-3, VAA-4, VAA-5, VAA-6, VAA-7 y VAA-8.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el serotipo del gen cap de VAA es VAA-2.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los genes rep y cap están integrados en el locus del gen de timidina cinasa (tk) del primer VHSr.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor para cada uno de entre el gen rep y el cap en el primer VHSr es un promotor heterólogo seleccionado de entre el grupo constituido por el promotor de CMV, el promotor precoz de SV40, el promotor de tk de herpes, el promotor inducible de metalotionina, el promotor de virus de tumor mamario de ratón y el promotor de beta-actina de pollo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el promotor heterólogo es el promotor de CMV o el promotor de beta-actina de pollo.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor en el segundo VHSr es el promotor de CMV.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el segundo VHSr comprende además un segundo gen de interés.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen de interés codifica para una molécula indicadora.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la molécula indicadora se selecciona de entre el grupo constituido por beta-galactosidasa, neomicina fosforotransferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, timidina cinasa, luciferasa, beta-glucuronidasa, xantina-guanina fosforribosiltransferasa, aminoglicósido, higromicina B, dihidrofolato reductasa/metotrexato y proteína verde fluorescente.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además coinfectar con un tercer virus recombinante seleccionado de entre el grupo constituido por un VHSr que difiere en construcción del primer y segundo VHSr, VAAr y un adenovirus recombinante (Adr) .

12. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 11, que comprende además transfectar con al menos un ADN de plásmido que incluye un vector de expresión de AVV.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la razón del primer VHSr con respecto al segundo VHSr es de

1:1 a 10:1.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la razón del primer VHSr con respecto al segundo VHSr es de 4:1 a 8:1.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la razón del primer VHSr con respecto al segundo VHSr es de 8:1.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, el que el gen de interés es un gen terapéutico.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el gen terapéutico se selecciona de entre el grupo constituido por alfa-antitripsina, GAA, eritropoyetina y PEDF.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer VHSr es un mutante de VHS defectuoso en ICP27 de replicación defectuosa seleccionado de entre el grupo constituido por un mutante de VHS d27.1-rc1, d27.1-rc3, d27.1-rc4, d27.1-rc5, d27.1- rc6, d27.1-rc7 y d27.1-rc8.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el mutante de VHS de replicación defectuosa es d27.1-rc8, que sobreexpresa ICP8.

20. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor para los genes rep y cap en el primer VHSr es un promotor homólogo seleccionado de entre el grupo constituido por p40, p5 y p19.

21. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor para los genes rep y cap en el primer VHSr o el segundo VHSr de replicación defectuosa es un promotor heterólogo.